Question

如何防止RNA提取过程中发生降解

Answer 1

我觉得RNA在提取过程中并不是很容易降解，匀浆可以用匀浆器，机械打磨的效果可能要比手工去 匀浆要高效一点。
我用的也是Tripure或trizol，所以并不太清楚应该怎么配试剂，下面的方法可以一试。
total RNA提取
Total RNA extract
1. cell Sample (50mg)+lysis (denaturation liquor) 0.5ml + β巯基乙醇1.6ul，充分混匀，此液体可放于-20℃保存1-2 months。组织则先进行匀浆。所有操作均在4℃进行。
2. +平衡酚（饱和酚）500ul (pH 4.0)，充分mixture for 3min
3. 2M 醋酸钠 50ul，混匀（pH5.2）
4. 氯仿/异戊醇 （49：1） 100ul，上下颠倒混匀
5. 冰浴 15min
6. 4℃ 13000rpm for 10min
7. 吸上清；加氯仿/异戊醇 500ul，摇匀2min
8. 12000g (13000rpm) for 10min
9. 吸上清，加异丙醇 500ul，混匀，-20℃沉淀20min以上
10. 12000g (13000rpm) for 10-15min
11. 弃上清，75%乙醇（4℃）500ul，洗沉淀
12. 12000g (13000rpm) for 10min
13. 弃上清， 37℃烤箱5min，或室温干燥
14. 取适量水溶RNA（1*TE）
15. –20℃或-70℃保存
Reagents
1 变性液
异硫氰酸胍 23.632g
柠檬酸钠 0.3676g
十二烷基肌氨酸钠 0.25g
+ H2O 至 50ml
2．2M 醋酸钠
8.2030g NaAC +ddH2O, 以HAC调pH至5.2, 加水至50ml
3．氯仿/异戊醇 （49：1）
4． 75%乙醇
From our lab
Result:
260/280=1.9左右
关键点：吸取水相时宁少勿多
本方法优点：简便，不需kit，费时少，费用低，细胞组织均适合，不需超高速，对大多数实验均适合
缺点：不能一步分离出蛋白质和DNA。不过我曾想同时抽提DNA，但没试过，但理论上是可行的。