Question

电泳无DNA条带，什么原因？

DNA提取的过程中，异戊醇沉淀出很多絮状沉淀，但是电泳却跑不出条带，而在最前沿有大团的亮点，想请教下各位那些亮团是什么？为什么会提不出DNA？Marker的条带很清晰哦，我提取的是植物的DNA，用的是嫩叶，用的是CTAB法。
我是在用异丙醇沉淀前加的RNA酶，37℃水浴1h，前面的亮点没有拖尾。如果我提的那个里面是蛋白质，除了加酶，还有什么别的方法除去？我用70％乙醇洗过两次哦。

Answer 1

二. 凝胶电泳
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
1、 DNA的分子大小:
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2、 琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、 DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
4、 电源电压
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
6、 离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温.
三、 琼脂糖凝胶的制备
1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。
2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、 加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
6、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
7、 观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。

[注意]4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。
5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。

Answer 2

异戊醇沉淀出很多絮状沉淀（应该是蛋白质多了，最好离心后用70%乙醇洗两次，有条件的话加点蛋白酶K）
在最前沿有大团的亮点（是不是象飞机场跑道那样拖尾得厉害？RNA太多了。有条件的话加RNA酶，没条件的话多洗几次）

根据我的经验，如果其他步骤没问题，很有可能是最后一步加TE时没有溶好，你在混匀器上转一下。还有，最后取样时候注意去中间的，不要取底部（蛋白质多）和上部（DNA浓度低）

抽DNA看似简单，对新手来说还是需要花时间熟悉。多找人问问，最好有前辈带你做一遍，很快的。

补充：抽DNA，并不是沉淀越多效果越好。DNA/RNA肉眼是无法看见的，你看到的沉淀，都是蛋白质。很有可能你的DNA已提出来了，但在染EB时由于量太少被蛋白质和RNA覆盖掉了。
建议你1重跑一次电泳看效果怎么样（有可能是DNA没溶好）；2吸取教训重提一次。

Answer 3

你好像打错了吧沉淀DNA的是异丙醇，不是异戊醇。异戊醇是和氯仿一起用来抽提蛋白的。不知道是你打错了还是真用异戊醇来沉淀DNA的。

我在一开始做实验的时候也遇到了你的问题。用异丙醇做了试验，沉淀出很多絮状还有点粘稠的东西，电泳什么都没有。后来改用无水乙醇就好了。你电泳的那些大片亮的东西是降解的DNA和RNA。

用无水乙醇来沉淀。就是在氯仿：异戊醇抽提两三次后，吸出上清，加入2/3体积的-20度遇冷的无水乙醇，就能看见沉淀了，但这时的沉淀较散，不好挑出。再在-20度放置30min左右，DNA就会结成团，很好挑出了。再用70%乙醇洗两三次。
这时得到的DNA还有大量的蛋白，最好再纯化一次，并用RNaseA处理一下，就很干净了。
你可以参考葛颂、邹俞苹编的《系统与进化植物学中的分子标记》。

要去除蛋白，在第一次沉淀出DNA后，这时的DNA呈白色，因为有蛋白。用500uL的TE或去离子水溶解DNA，然后加入RNaseA，水浴，这时再加无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，这时得到的就是无色的絮状物了，再用70%乙醇洗。这就叫纯化，得到的DNA很干净，但损失很多。蛋白或其它杂质较多的DNA比较难溶解，较纯的DNA很好溶解。

Answer 4

第一减少抽的样，样品不是越多越好。
第二酚氯仿多抽几次，抽的时候体积大一点，水相不要都吸走。

估计你沉淀下来的白色沉淀是蛋白和RNA。建议你下次抽的时候加15mg/ml蛋白酶K55度处理两个小时消化蛋白。
还有一种可能就是RNA太多了，前面的大团是RNA,说明细胞质已经破了，但是细胞核有没有破还不清楚。你看看胶是不是跑成刀鞘状后面是深黑色？那就是跑在前面的RNA把胶里面的EB全部吸掉了，导致DNA无法结合EB不能发光.你下次抽得DNA以后用RNA酶处理一下，用0.6%的胶上个梯度看看，也许RNA少了就能跑出DNA来了。(或者跑胶以后在EB里面再染色半小时)
向你推荐天根公司的核酸抽提手册，很好用.

Answer 5

你经过PCR没？直接提取的DNA含量很低的，不可能跑出来的
你的marker很亮，所以EB应该是没加少的，建议PCR时引物的浓度提高点，再试试看。
你说絮状沉淀很多，可能是你提取的杂质有过多，一般DNA要冷冻离心后，可以在离心管上看到有白点就是很多了。
你要提取蛋白质，出了加酶还要加的酶的抑制剂，不然你的蛋白也被水解了，或者加酶除细胞壁后通过提高温度、表面活性剂等来灭活酶。你用电泳蛋白质本来就要变性的。如果不使期变性还是用亲和色谱。