Question

现代分子生物学技术与植物病毒病的防治方法有哪些？

Answer 1

选育抗病品种是防治病毒病最经济有效的方法，但常规育种的缺陷限制了符合农业生产要求的抗病品种的产生。现代分子生物学技术的迅猛发展给抗病毒育种开辟了新的途径。迄今为止，人们已研究出了许多来获得转基因抗病毒植物的方法。

1.外壳蛋白介导的抗性

病毒上存在一种交叉保护现象，即当一种弱侵染性病毒侵染植株后，该植株就获得了一种抵抗强侵染性病毒侵染的抗性。1986年，美国的Beachy研究组利用此原理将烟草花叶病毒（TMV）的外壳蛋白基因（CP基因）导人烟草，首次获得了抗TMV的烟草植株，开创了抗病育种的新纪元。病毒外壳蛋白是一种存在于绝大多数病毒中的结构蛋白，且是其中含量最多的一种蛋白。在转外壳蛋白基因的植物中表达这种蛋白以后，就可以产生类似交叉保护的效果，大大减弱了以后病毒对转基因植物的侵染及进行系统性传播的能力。这种抗病毒作用存在于病毒复制的早期，并能导致病毒的重要成分的合成受阻。近几年来，病毒外壳蛋白基因法被用来提高植物对多种病毒的抵御力，包括TMV、黄瓜花叶病毒（CMV）、苜蓿花叶病毒（ALMV）、烟草条纹病毒（TSV）、烟草脆裂病毒（TRV）、马铃薯X病毒（PVX）、PVY、烟草蚀刻病毒（TEV）等12个属近20种病毒。另外，国内还成功地克隆了水稻和小麦黄矮病毒的外壳蛋白基因。采用这一方法培育成功的抗病毒转基因植物有烟草、苜蓿、番茄、马铃薯等。尽管用这种方法不能获得对病毒的完全抗性，但可获得高水平的抗性。而且来自于一种病毒的外壳蛋白基因有时对不相关的病毒可提供广谱抗性。通过转基因植株所进行的田间试验和实验室研究证明了这种方法的可行性。

2.利用缺损的复制酶

研究表明，向植物体内转入缺损的病毒复制酶基因，表达出的无功能的缺损的复制酶可以与有功能的复制酶相互竞争，从而干扰病毒的正常复制。1990年Golemoboski将烟草花叶病毒TMVul株系的非结构基因（54ku基因）导入烟草，获得了对TMV免疫性抗性的工程植株。将豌豆早枯病毒（PEBV）的复制酶C端编码序列转入烟草后，转基因烟草对PEBV、胡椒环斑病毒（PRV）和烟草脆裂病毒都表现出抗性。将黄瓜花叶病毒的复制酶基因通过限制性内切酶切去其活性中心的GDD区域后，将缺损的基因转入烟草，转基因烟草对缺损的复制酶株系相同的病毒具有抗性。目前利用缺损的复制酶获得抗病毒活性的作用和机理还停留在假说阶段，不过从现有的结果看，利用该策略获得具有抗病毒活性的转基因植物是大有前途的。

3.干扰运动蛋白

病毒在植物体内的传播途径主要依赖于运动蛋白。运动蛋白可与胞间连丝相互作用，促进病毒在细胞间的转移。如果能够干扰或阻碍运动蛋白与胞间连丝的结合，就可以阻止病毒在植物体内的扩散，将已侵入植物体内的病毒局限在最初的侵染部位，从而达到抗病毒的目的。因此人们正在尝试设计一种或几种分子转入植物，特异性地封闭运动蛋白或与运动蛋白相互竞争，从而获得具抗病毒活性的转基因植物。

以上3种策略在本质上都是由转基因序列表达蛋白质量的多少来决定抗性水平高低的。因此这类抗性常称作蛋白质介导的抗性。其主要特征是抗性水平与转基因的蛋白质表达的量成正相关。但是，随着研究的深入，研究者们发现许多与此不符的情况。如在一些高度抗病的转基因植物内，转基因蛋白表达量很低，甚至根本检测不到。当将病毒转基因的起始密码除去后，转基因植物仍可以高度抗病，有的甚至免疫。这是不同于蛋白质介导的另一种抗性。

4.RNA介导的抗性

1992年3个研究小组同时报道了用非翻译的序列转化植株也能产生抗性，所抗病毒分别是番茄斑萎病毒（TSMV）、烟草蚀纹病毒（TEV）和马铃薯Y病毒（PVY）。它们的抗性表现型与用能翻译的DNA序列转化所获得的植株抗性表现型相似，但却与蛋白质介导的抗性明显不同。在RNA介导的抗性中RNA积累水平对病毒侵染的抗性水平之间无直接关系。有研究表明，细胞内RNA含量和抗性水平之间存在着反向关系。在RNA介导的抗性中，转基因可以高水平转录，却没有大量稳定的RNA积累。转基因植株中有一种普遍现象，即基因沉默，又叫外源基因失活。基因沉默有转录基因沉默（TGS）和转录后基因沉默（PTGS）两种。TGS是指基因在转录水平上的沉默，即基因不能被正常转录；PTGS是指基因能被正常转录，但所转录的RNA在细胞内积累很低或根本检测不到。这两种基因沉默都可以称为同源依赖的基因沉默。其中转录后的基因沉默一般是外源基因与同缘的内源基因一起发生沉默，即所谓的共抑制。由于转基因在植物体内可以转录，却没有大量的RNA的积累，所以RNA介导的病毒抗性也被认为是一种PTGS。关于RNA介导抗性的分子机理虽然没有统一和明确的认识，但许多研究者已对此做了许多有益的探讨。Lindbo等在用烟草蚀纹病毒（TEV）接种转TEV外壳蛋白基因的烟草植株的实验中得出，转基因RNA水平降低是由一种被诱导的转录后抑制过程所造成。Pang等认为，RNA介导的抗性的诱导依赖于所转基因的长度。当植株用非翻译的TSWV核蛋白基因片段91（110～235个核苷酸）转化时，未观察到植株的抗病性。但当这些相同的片段与非靶子的绿色荧光蛋白（GFP）基因融合后转化植物时，这些转基因植物就表现出抗病性。这表明一个临界的转基因的长度对诱导RNA介导的抗性是必需的。

基因沉默对转基因的表达也许是不利的，但从植物抗病毒育种的角度来看，这种类似共抑制现象的抗病性却是一种新的抗病毒策略。与蛋白质介导的抗性相比，RNA介导的抗性具有高抗或免疫、抗病性持久和生物安全性高等特点。

5.卫星RNA介导的抗性

所谓卫星RNA（SatelliteRNA）是指在复制和包装时需其他病毒的小分子RNA，与辅助病毒在核酸序列上没有任何同源性。卫星RNA只要在辅助复制酶病毒的衣壳中，在体内和体外都有很高的稳定性。实验表明，卫星RNA可以干扰和抑制辅助病毒的复制。因此，人们认为可以把卫星RNA转入植物从而获得抗病毒的转基因植物。1986年Bawlcome等成功地将CMV卫星RNA导入烟草，获得了表达全长序列卫星RNA的工程烟草植株，对该病毒或相关病毒的复制和症状表现有抑制效果。1988年，吴世宣、田波等将CMV的卫星RNA反转录为CDNA，加上调控序列，通过Ti质粒引入烟草，从而在我国首次培育出抗CMV的烟草植株。

6.反义RNA介导的抗性

用于翻译蛋白质的RNA称为正义RNA，互补于一般转录所得的mRNA的RNA分子称为反义RNA。反义RNA与正义RNA形成双链分子，从而阻碍翻译的进行，导致基因产物合成减少。从理论上说，把互补于病毒外壳蛋白mRNA的反义RNA转入植物，应有可能阻碍病毒复制和减轻病毒对植物组织的危害，获得抗病毒的转基因植物。人们将CMV外壳蛋白基因的正义和反义RNA分别转化烟草，然后测定转基因植物对病毒侵染的敏感度，以此来比较病毒外壳蛋白基因及其反义RNA转化这两种方法的效果。结果表明，外壳蛋白的反义RNA一般比正义RNA所能提供给植物的保护更少。以后又有实验表明，反义RNA导入并不能使植物产生抗性。因此，采用反义RNA来获得具有抗病毒能力的转基因植物还需要做出更大的努力。

7.中和抗体基因

它是利用抗体对病毒的中和作用而达到防病的目的。其方法是将对病毒有中和作用的抗体基因转移到植物中进行表达。国际上已经成功地将小白鼠杂交瘤细胞的cDNAR转移到酵母中表达出有活性的抗体，并且在抗体基因的克隆方法和改造上有了新的突破。在高等植物中抗体基因的表达和有相同活性抗体的产生已被证实。抗体在植物细胞内与病毒结合有可能阻止病毒的进一步侵染。因此，作为抗病毒基因工程的一条新的途径已受到国内外广泛重视。

刘德虎等（1996）已进行了马铃薯Y病毒小鼠中和抗体轻链基因的克隆和序列分析，为该病毒中和抗体基因工程打下了基础。

8.其他策略

核酶（Ribozyme）是一种能特异切割RNA的RNA，依据已知的病毒基因组的特定区域序列设计R2，使它能特异地识别、切割病毒的特定区域，从而切断病毒基因组，破坏其生物能力，已有不少成功的报道。另外，还有植物来源的基因介导的抗性，植物在长期进化过程中形成一套对付病毒等病原的防御系统。如何激发、利用植物本身的这种抗性机制，从植物体内找出有用的、关键的抗性基因，将是发展植物抗病毒基因工程的另一方向。我国将现代分子生物学技术应用于植物的抗病毒育种起始于20世纪80年代末90年代初，目前已将TMV、CMV、PVX、PVY、PLYV、RDV和BYDV等病毒的基因转化烟草、番茄、辣椒、马铃薯、番木瓜、小麦和水稻等，获得了多种抗病毒转基因植物，有的已进入大田试验。