Question

请大家帮我看看我的双酶切连接转化过程哪儿出错了

载体用的是pET21a(+),目的片段是AKP，通过BamH I和Nde I双酶切，然后在22度连接2小时进行转化，挑转化质粒结果特别奇怪如下图

1泳道是DNA分子marer，2-13为转化质粒，14为pet21a空载体对照，怎么会在3000和2000之间出现质粒条带呢，而且2和13质粒大小貌似和空载体一致，完全没有正确的阳性克隆，我的AKP目的条带是通过重叠延伸PCR做出来的，是AKP和另一段250bp大小的基因延伸出两段分别为Nde I和BamH I酶切位点的目的基因，大小约为1750bp，不过PCR时出现了非常明显的非特异性条带，如下图

上图中最后3个泳道中上面亮的条带为我的目的条带，下端为非特异性条带，切胶回收后发现目的条带大小是正确的

2到5为切胶回收的目的片段，6为没有重叠延伸的AKP基因，7为250bp的基因，从图上看目的片段也对，但是连接转化后为何会出现最上面图的情况呢，感觉大部分质粒都像是目的片段自连的一样，但是自连的目的片段怎么会有抗性呢，期待大家得解答
对了，这是我的酶切回收结果，左边两个位目的片段酶切前后，右边两个为pET21a酶切前后，都酶切了5.5个小时

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Answer 1

pcr没有问题。而且双酶切一般不会出现片段自连的情况。所以那个条带不是目的片段的自连，而是超螺旋的质粒。
要鉴定片段是否插入了载体，最好用双酶切进行鉴定。
若是空载严重，应该是载体自连，或者酶切不充分。

追问

但我平常的超螺旋都是和泳道2差不多大小的啊，怎么会在3000bp出现条带呢，感觉不像是载体超螺旋啊，但为什么会有抗性呢

如图，左侧是我以前做的一次，左边是AKP部分，右边是另一个，另一个泳道2已经验证正确了，但AKP总是验证不出来，总是失败质粒大小不是和空载一样，就是在3000bp，左右，不知道是什么东西，快毕业了，可郁闷，谢谢您的帮忙了

追答

我觉得你的酶切有问题。
不知道你用的限制酶酶切条件是什么，可适当加酶量和酶切时间。

追问

最下图那次我的是20微升体系，两种酶都是1微升，酶切时间4小时,但为什么另一种也是和250bp重叠延伸出的750bp的目的条带做成功了呢？
上面那次是两种酶1.5微升，酶切5.5小时，用的都是Buffer Tango，赛默飞的酶

追答

重新切载体和pcr片段，再连一次。
pcr产物过夜酶切。
做出来的重组子用双酶切做鉴定。

追问

我目的片段过夜酶切后所提转化质粒还是在3000bp左右，而且PCR根本就验证不出来目的片段，不知道是什么东西

追答

做出来的东西送去测个序

Answer 2

PCR没有问题。双酶切，一般不会发生，因为即使是碎片。因此，该带的目的不是自连接的片段，但超螺旋质粒。
识别该片段被插入到载体中，它是最好的双重消化进行鉴定。
如果卸载严重，应载体连接，或没有完全消化。

追问

您好？没看明白您的回答，我目的片段过夜酶切后所提转化质粒还是在3000bp左右，而且PCR根本就验证不出来目的片段，不知道是什么东西