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文献分享 — crispr-cas9技术诱导拟南芥同源染色体易位

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大家好，本周给大家分享的是一篇发表在nature plants上的关于 crispr-cas9技术诱导拟南芥同源染色体易位 的文章。

文章题目： CRISPR–Cas9-mediated induction of heritable chromosomal translocations in  Arabidopsis (CRISPR-Cas9 介导的拟南芥遗传染色体易位诱导)

期刊： Nature Plants

影响因子： IF = 15.793;

发文单位： 德国卡尔斯鲁厄技术研究所,德国莱布尼茨植物遗传学和作物植物研究所(IPK)等单位。

摘要： CRISPR–Cas9技术主要应用于植物育种中，用于改善单或多性状的基因。此文献展示了这种技术也可以用于重组植物染色体。利用金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶，本文实验团队诱导了拟南芥异源染色体间Mbp范围内的相互易位，并观察到在没有经典的非同源端连接途径的情况下，易位频率大约提高了5倍。通过分子和细胞学分析，作者证实了拟南芥1号、2号染色体之间，1号、5号染色体之间的染色体臂交换是保守的和互作的。染色体易位的诱导可以模拟基因组的进化或有方向的修改染色体、固定或打破不同染色体性状之间的遗传联系。植物基因组的可控重组具有改变植物育种的潜力。

实验思路：

       DSB的修复途径主要为以下两种，在植物中NHEJ是体细胞中普遍存在的修复途径。一次诱导多个DSB可以通过NHEJ连接不相关的断裂末端，导致基因组重排。因此在异源染色体上同时诱导两种DSB可能会导致相互易位的形成。

实验方案：

       为了形成易位，实验使用来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶(SaCas9)诱导拟南芥1号染色体(Chr1)和Chr2上的两个dsb (TL1-2)。Cas9核酸酶的靶位点被设计为切于Chr1和Chr2长染色体臂末端0.5 Mbp的基因间区域(图1a)。为了确定CRISPR在体细胞中造成的易位频率事件，我们通过农杆菌介导的浸花方法对col0植株中的CRISPR构建物进行了转化，并选择生长两周后的植株为初代转化子。设置了6个生物重复，每个重复收集100株植物用于提取基因组DNA。使用带位点特异性引物的数字滴式PCR(ddPCR)对易位频率进行定量测量，连接位点附近序列的变化作为鉴定到易位的标志。实验检测到TL1-2在两个连接处的易位频率约为0.01%，表明使用CRISPR-Cas9确实可以实现染色体臂的相互交换。为了确定哪些修复途径参与了植物体细胞易位的形成，实验通过下一代测序(NGS)检查了连接位点的序列模式。序列显示在野生型背景下，约60%的事件显示无错连接，其余事件为小规模序列缺失。大多数情况下没有核苷酸丢失，最可能的原因是新连接为嵌合连接，与最初切割位点相反，不能再被Cas酶识别。这说明主要是cNHEJ通路导致了染色体易位的形成。同时还分析了在敲除cNHEJ关键酶KU70后易位的形成。结果显示，敲除KU70使易位频率增加了约5倍，接近0.05%。这说明在没有cNHEJ的情况下，aNHEJ能够有效地形成易位

       实验通过遗传转化得到T0代初级转化子，T0代授粉自交得到T1代，T1代进行基因分型挑选出40个含易位事件的植株进行T2代植株种植培养。40个T2植株混样提取DNA进行基因分型筛选，另外同时进行单株的筛选。挑选具有易位事件的单株进行T3代种植培养。单株检测易位事件随后继续分离培养。c-e：半合子状态下的相互易位分离示意图。T2植株的染色体组分别有野生型(1和2)和嵌合型(J1和J2)拷贝(c);因此，它们的配子要么携带野生型单倍体染色体组，要么携带易位染色体组，要么携带缺乏部分遗传信息的两组染色体(用红色十字标记;d);在T3代中，如果所有4个配子都没有偏置转移到下一代，理论上可以产生16种基因型组合(e)。然而，一半(8)的受精事件会导致染色体不平衡(黄色)，两个细胞将失去遗传信息(红色)，只有六个组合(绿色)可以解释一个平衡的二倍体后代。在这六种平衡的基因型中，有四种是杂合子的易位，这意味着它们同时携带原染色体和重组后的染色体。两种基因型来自不平衡的配子组合(浅绿色)，两种来自平衡的配子组合(深绿色)。因此，如果不平衡的配子不能贡献后代，16个合子中只能产生4个存活的合子(1个纯合子野生型，2个杂合子易位和1个纯合子易位)，导致易位染色体的准孟德尔分离(1:2:1)。T2分析中，所有转化株系均检测到两个连接位均为阳性的植株，Col-0和ku70-1的易位频率分别为0.125%和0.5%。在得到的T3代中，每个T3株系筛选到40株，由于没有检测到不平衡的染色体组，观察到向平衡后代的转移。用χ2检验检验易位连接的拟孟德尔分离。

       通过使用不同DNA探针，针对Chr1(红色)和Chr2(绿色)易位断点区域进行FISH，观察到了野生型和易位植株有丝分裂和自然延伸的粗线期染色体。遗传易位事件的两个连接位点J1(b)和J2(c)的测序结果显示在野生型背景的4个T4细胞株中，有3个细胞株在两个连结处均无错误连接，另一个细胞株在一个连结处有小的缺失。两者都分析了ku70-1背景下的易位事件在两个连接处的突变特征是aNHeJ修复。

       相同的实验流程在Chr1和Chr5之间进行了易位诱导，野生背景下携带易位事件的40个T2株系中有一个单株为易位阳性，T3分析未检测到配子不平衡导致的基因型，10%的子代为纯合子易位。测序分析显示两个连接位点都有小的缺失。使用不同标记的探针对易位区域进行FISH，三次重复结果一致表现易位现象。

a ，四个不同编辑位点上SaCas9的编辑效率    b ，Col-0在连接位点上的缺失多为中小缺失，而ku70突变体在两个连接位点上的缺失量较大。 c ，在野生型中，大多数连接是直接连接的，在连接位点没有任何突变诱导。在显示连接位点突变的reads中，大多数连接不使用MHs，只有少数连接使用MHs。相比之下，在ku70突变背景中几乎没有无错误的连接发生，在连接位点普遍的修复模式显示使用MHs连接。 d, e ，野生型和突变型中两个连接位点在序列水平上最常见的10个reads的详细表示。

     为了证明没有序列信息丢失，在易位染色体上每100kb扩增出一个约2.5kb的典型扩增。图a。易位染色体部分PCR扩增产物的凝胶电泳图显示易位染色体每100KB就能检测到一条条带，表明易位形成过程中没有信息丢失。作为PCR对照，将未易位形成的野生型基因组DNA(阳性对照)和水(nTC=无模板对照，阴性对照)同时处理，并加载在不同的凝胶上。表型分析和育性分析(测量5个生物学独立样本的角果长度和种子数)显示易位植株和野生植株并无差别。d,e，育性分析是通过测量5个生物学独立样本(n=5)的角果长度和计数种子数进行的。Barplots显示平均值，errorbars为mean±s.d。对于两个携带TL1-2的分析品系，我们无法检测到任何差异。

文章链接地址： https://www.nature.com/articles/s41477-020-0663-x