Question

我自己设计引物，每次PCR结果条带大小都不一样，还有时候有有时候没有。操作没问题，我是不是应该换引物

其中一次模板，是之前师兄已经构建好的质粒（含我要得目的片段），可以P出好几条带；我胶回收单一条带后，酶切又变成两条。一条我要得大小（1700左右），一条500左右。之后连接转化就做不成功了。
另两次次模板是原植物（水稻）逆转录的结果，RNA很好，RT应该也没有问题。但一次P不出，一次P出来1400bp多的
请问如果实验结果变数这么大，是不是引物特异性不够呢？

Answer 1

在已经构建好的质粒上P条带，如果有非特异性扩增：
1.提高退火温度，或者加DMSO
2.引物设计有问题，与载体的全序列做一下BLAST
3.模板问题，有些模板如果是高GC含量等原因，很难P

Answer 2

怎么不去小木虫上问问啊，百度知道还是不太学术的地方。我个人认为引物可能是有问题的，可以再查查