Question

微生物学基础，微生物的特征检查噬菌体有哪些方法

Answer 1

5 方法
5.1 噬菌体的检查
5.1.1 样品采集
将2～3g土样或5mL水样（如阴沟污水）放入灭菌三角瓶中，加入对数生长期的敏感指示菌（大肠杆菌(Escherichia coli)）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。
5.1.2 增殖培养
30℃振荡培养12～18h, 使噬菌体增殖。
5.1.3 离心分离
将上述培养液以3000rpm离心15～20min, 取上清液，用pH7.0，1%蛋白胨水稀释至10-2～10-3，用于噬菌体检查及效价测定。
5.1.4 生物测定法
5.1.4.1双层琼脂平板法
5.1.4.1.1 倒下层琼脂
融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
5.1.4.1.2倒上层琼脂
融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌(Escherichia coli)) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
5.1.4.1.3恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
5.1.4.1.4 观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──????噬菌斑。
5.1.4.2 单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6～16h后观察结果。
5.1.5 离心分离加热法（快速检查）
取大肠杆菌(Escherichia coli)正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌(Escherichia coli)培养液，4000rpm离心20min，分别取两组发酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A2），检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。
5.2 噬菌体效价的测定
5.2.1 倒平板
将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
5.2.2 稀释噬菌体
按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。
5.3 噬菌体与菌液混合
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌(Escherichia coli)菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
5.4.4 接种上层平板
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37℃培养。
5.5 观察并计数
观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30～300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。
计算公式： N=Y/V?X
　 （N：效价值，Y：平均噬菌斑数／皿，V：取样量，X：稀释度）
例如：当稀释度为10-6时，取样量为0.1 mL/皿，同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：N＝186／0.1×10-6＝1.86×109。

6 结果
6.1 噬菌体检查
6.1.1离心分离加热法
处理方法 OD650光密度值
正常发酵液（对照） 异常发酵液（试验）
离心上清液(A1)
离心上清液加热煮沸后(A2)
A2/A1
6.1.2 绘出平板上的噬菌斑检测结果，指出噬菌斑和宿主细菌。
6.2 噬菌体效价测定
6.2.1 平板上噬菌斑数目
噬菌体稀释度 10-4 10-5 10-6 对照
噬菌斑数（个）/皿
平均每皿噬菌斑数目
6.2.2 计算噬菌体效价(即噬菌斑形成单位pfu, plague-forming unit).
7 思考
1有哪些方法可检查发酵液中确有噬菌体存在？比较其优缺点。
2测定噬菌体效价的原理是什么？要提高测定的准确性应注意哪些操作？
3噬菌体与菌液混合后保温时间越长其吸附率越高的说法对吗？
回复
吸收率：在噬菌体和过量菌液混合后，菌/噬菌体混合液中未感染的噬菌体颗粒经过氯仿处理后，在不同时间点检测其数量。一般情况下几分钟内噬菌体即可大部分吸附到宿主菌上.
潜伏期：细菌与噬菌体混合作用5分钟后，彻底清洗以除去未结合的噬菌体。然后用新鲜的培养基重悬至相同体积。该重悬液在370C下孵育，其间有规则地收集噬菌体测滴度。
裂解量指的是单个宿主细菌被噬菌体完全裂解后所释放的噬菌体数量.具体检测方法本人也不是很清楚.