Question

血液提取DNA的有关问题

Answer 1

1
材料和方法
　　1.1
样本来源
静脉抽取30份健康体检者血样。10份用EDTA抗凝,
10份不加抗凝处理，10份不抗凝在-40
℃冻存2
a左右。
　　1.2
DNA提取方法
取凝血块，用9
g/L
氯化钠匀浆大约30
s，每换一个样本都要用70%乙醇和9
g/L
氯化钠清洗匀浆器以避免交叉污染。取匀浆后样本1
ml置于离心管中，室温8
000
r离心5
min后，去掉上层。血细胞在1
ml的Tris缓冲液I(10
mmol/L
TrisHCl，pH
8.0；10
mmol/L
氯化钾；10
mmol/L
氯化镁；2
mmol/L
EDTA，pH
8.0；25
mL/L
Triton
X100)中裂解10
min,
其间轻轻用力充分混匀,
室温10
000
r离心2
min，沉淀要用Tris
缓冲液I洗2次。将沉淀用220
μl的Tris
缓冲液II
(10
mmol/L
TrisHCl，pH
8.0；10
mmol/L
氯化钾；10
mmol/L
氯化镁；2
mmol/L
EDTA，pH
8.0；0.4
mol/L
氯化钠；10
g/L
SDS)悬浮，轻轻振荡试管,
使底部细胞团块散开，在56
℃保温15
min裂解。加入100
μl
5
M
氯化钠充分振荡沉淀去除蛋白质。10
000
r离心5
min，取上清。加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA后，10
000
r离心5
min，弃上清。室温晾20
min左右待酒精挥发干净后以适量TE缓冲液(10
mmol/L
TrisHCl，pH
8.0，1
mmol/L
EDTA)回溶。EDTA抗凝血中DNA的提取从去掉上层开始。
　　1.
3
DNA浓度检测
用分光光度计在260
nm测DNA浓度。
　　1.
4
DNA纯度检测
DNA的纯度用A260/A280比值表示［3］。结果以均值±SD表示。
　　1.
5
DNA分子量检测
DNA样本的完整性用0.7%琼脂糖凝胶电泳证实，溴化乙锭染色，紫外灯观察。
　　1.
6
PCR检测
PCR扩增组织型纤溶酶原激活因子(tPA)第8内含子Alu等位基因插入(I)和缺失(D)二态性［6］来评价DNA的可靠性。PCR引物序列如下：Alu1
5'GTA
AGA
GTT
CCG
TAA
CAG
GAC
AGC
T3',
Alu2
5'CCC
CAC
CCT
AGG
AGA
ACT
TCT
CTT
T3'。反应体系组成为：10×PCR
buffer
5
μl
,
25
mM
氯化镁
6
μl
,
10
mM
each
dNTPs
1
μl
,
10
μM
primer上下游各1
μl
,
DNA
2
μl
，Taq酶1
μl
。PCR反应程序为：95
℃5
min预变性，然后94
℃
1
min
,58
℃
1
min,72
℃
2
min循环40次，在72
℃充分延伸10
min。
　　1.
7
结果
以均值±SD表示。
　　2
结果
　　凝血和抗凝血的DNA产量和纯度(A260/A280)相似。这些数据和用蛋白酶K处理及有机溶剂提取的相似［7］，比其他盐析程序报道的要高［1，5，7］，见表1。
　　表1
从冻存的和新鲜的凝血以及EDTA抗凝血中提取的DNA的浓度和A260/A280比值（略）
　　凝胶电泳显示所有样本的DNA分子量都很高(图1)，而且从两者的DNA样本中能很容易地扩增出tPA基因的第8内含子区Alu等位基因二态性(图2)。这些表明，此方法能有效地从血液中提取出基因组DNA。
　　图1
抗凝血、凝血和冻存凝血DNA提取比较。抗凝血DNA(1-2)、凝血DNA(3-5)和冻存凝血(6-8)DNA琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析。M－DNA
Marker(λEcoT14
I
digest,
购自TaKaRa)。（略）
　　图2
PCR扩增
tPA
8th
内含子Alu等位基因插入/缺失(I/D)二态性结果。lane1、3、6为I/I；lane2为D/D；lane4、5为I/D。（略）