Question

siRNA转染答疑专题总结（下）

Answer 1

Q9: 刚开始做实验，准备把RNAi的片段转入染色体内稳定表达，不知道是shRNA还是siRNA哪个比较好而且效率比较高？另外，一个载体里同时放两个针对不同基因的shRNA会不会相互影响？

A9: 稳定转染当然是shRNA。关于一个载体2个shRNA，涉及到2个shRNA的表达和加工的问题，关键还是2个shRNA都需要顺利表达的问题，这就和你的载体，以及2个shRNA在载体的排列有关系。至于蛋白之间的相互影响，应该考虑到了。

Q10: 用慢病毒来包装siRNA来转染细胞，如何确定转染成功的细胞具有稳定性？这种细胞最多能够稳定传代多少代啊？

A10:我理解你的稳定性是指在子代细胞中也同样出现RNAi效果。瞬时转染的siRNA会在培养传代过程中，不断被降解稀释，以至消失。如果需要在子代中也永久有RNAi，必需将相关siRNA基因整合到细胞基因组中，并表达。一般来说，如果感染并传代2周以后，RNAi效应仍然非常明显，可以初步认定是稳定的。稳定传代的细胞系根据细胞的不同，可以传很多代的。

Q11: NCBI里查到的目的基因有3个mRNA,但是合成siRNA只能选择其中一条mRNA , 目前已有的文献也没有做这个的，该如何选择呢？

A11: 3个mRNA可能至少产生3个蛋白，研究哪个蛋白就选和这个蛋白相关的mRNA，如果不产生蛋白，就根据独立的功能对应的mRNA来研究，如果是研究这个基因的全部功能，就分各个mRNA来分别研究。

Q12: 阴性对照应该是与目的基因的序列无同源性的，那如何评价转染效率？

A12: 带荧光的siRNA，不考虑序列，转染进去细胞内即可出现荧光，故可用于优化转染条件和评估转染效率。而沉默效率则和siRNA序列相关。

Q13: 请问细胞水平实验，选择载体表达的shRNA还是小片段的siRNA?
请问两种在转染效率和沉默时间等有什么区别呢？

A13:根据实验需要沉默的时间来确定是用shRNA还是siRNA，1周以内的短期抑制，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长，缺点的需要构建相关载体。效率上，根据具体细胞，实验情况，各有千秋。

Q14: 转染后背景很脏，都是黑点（疑似黑焦虫）在原地运动。做了LB检测，确定该黑点不是细菌，最后发现黑点来源于抽提的质粒，请问有什么办法可以解决吗？

A14: 这种黑点，如果确定不是细菌，多是凝聚的蛋白，还有DNA等的沉淀产物，有人又把它叫“黑胶虫”。人们看到可以动，认为是生物，其实只是布朗运动。这和血清、细胞、转染试剂等都有关系。如果不影响实验，可以通过换液来除去。

Q15: 慢病毒转染多长时间后进行干扰目的基因和蛋白的检测？

A15:如果用慢病毒进行瞬时表达，一般至少需要24-48小时，慢病毒基因组是RNA，需要反转录成DNA，再生成siRNA，再干扰，才会发生作用。这个过程和细胞类别、细胞活性、慢病毒具体载体等等有关系。建议取不同时间点检测。另外，慢病毒一般都带筛选基因，可以考虑做稳定表达。如果只做瞬时表达，可考虑用转染试剂，成本、时间、方法都要省很多。

Q16: 21nt,22nt,24nt的siRNA如何进行电泳分辨？

A16:PAGE分析，即聚丙烯酰胺凝胶电泳，理论上可以分辨1bp，实际上，在引物的纯化中也常用此种凝胶进行纯化。但由于siRNA很容易降解，尤其在电泳时，需要接触的液体、器皿等都很多，很容易造成在电泳过程中的降解，这样电泳就不易分辨了。如果一定需要分辨，可以采用HPLC或质谱的方法。

Q17: RNAi很容易降解，转染效率很低。EntransterTM产品一般采用什么策略和技术来防范呢？

A17:RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。对siRNA的降解，可以合成修饰的双链siRNA，以提高合成中的稳定性，使用合成好的siRNA，尽量严格做到不要受RNA酶的污染。对转染来说，因为要接触血清，培养基以及细胞内酶的作用。这时，好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时，保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响，同时在进入细胞后不被溶酶体降解，并能释放到细胞质中。好的转染策略还不仅有保护的作用，更重要的是浓缩siRNA，不将细胞外的其他成分，特别是毒性成分，如抗生素、过多的蛋白带入细胞，以避免细胞产生毒性反应，毒性对RNAi实验来说，影响非常大。