Question

如何防止核酸降解基因组DNA?

大肠杆菌核酸的提取纯化、琼脂糖电泳鉴定与紫外分光法定量的实验中，如何防止核酸降解基因组DNA?

Answer 1

1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。

2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。

3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。

4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充分悬浮菌体细胞。

5、加入12ml新配制的溶液II， 盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10分钟。

6、加9ml用冰预冷的溶液III， 摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。

7、4℃下5000g离心15分钟。

8、取上清液，加入50ml RNA酶A(10mg/ml)， 37℃水浴20分钟。

9、加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。

10、取上层水相， 加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。

11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000)， 冰上放置60分钟。

12、4℃下12000g离心15分钟， 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。

13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。

2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和，切忌剧烈振荡。

3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时)，使DNA酶失活。