Question

核酸电泳的注意事项

Answer 1

1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
3. 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常更新电泳缓冲液。
4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

回收率低或为零
1. 漂洗缓冲液中没加入乙醇.在使用前应确保乙醇已加入漂洗液PW中。
2. 吸附材料上有乙醇残留.洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，因含乙醇会降低洗脱效率。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液。
3. 洗脱缓冲液pH值偏低.DNA只在低盐buffer中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。
4. 洗脱液加入位置不正确.洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大洗脱效率。
DNA质量不好
洗脱产物含有乙醇残留.洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液