Question

关于精子的冷冻保存

老师让我一个人做这个科研课题，还要写论文，请各位了解的师兄师姐们帮帮忙吧，谢谢了

Answer 1

经过3-7天禁欲后，用手淫方法取得精液。梗阻性无精者可经附睾或睾丸穿刺取精进行检查和处理。借精者精液来自精子库中的冷冻精液。精液处理主要为达到者精液来自精子库中的冷冻精液。精液处理主要为达到合符要求的活动精子密度，去除精浆及精液中的死精子、白细胞、抗体等成分，减少精液的粘稠性，促进精子获能，改善精子受精能力。根据精液常规检查的结果，选用不同的处理方法，包括：（1）精子上游优化法：将精液标本按l：l加入培养液以下，置37℃、5％C02条件下孵育30分钟，收集上层液，200转离心10分钟，弃上清液，0．5m1培养液将沉淀悬浮做授精用；（2）Tyrode溶液法：选Tyrode溶液为培养液，其他同前；③Percoll精子洗涤浓缩法：适用于精子动力差者。试管中由下至上依次置90％Percoll2ml，45％Percoll 2ml，精液lml，500转离心20分钟，吸出沉淀，lml培养液悬浮，200转离心10分钟，弃上清液，O．5ml培养液将沉淀悬浮做授精用。通常采用上游法处理，筛选出质量好的精子与卵子结合。精液加入冷冻保护剂后可以保存在液氮中。

Answer 2

冻精就是冷冻精子，即男性从未来生育计划考虑，将自身精子冷冻于具有相应资质的医疗机构中，以防未来生育风险。巢内美国的精子冷冻技术已较成熟，精子冷冻可以作为不孕不育者的一种辅助生育手段，一些非常严重的少精症患者，可以在治疗过程中将珍贵的精子冷冻保存，用以进行卵胞浆内单精子注射治疗，以防日后发展成无精症，以致彻底丧失了做父亲的能力。
临床上将通过自慰射出的精液收集，取少量做抽样检查后，剩下的加入保护剂，超低温（零下100多℃）冷冻起来。需要使用的时候，将储存精子的样品管于室温下浸在自来水或双蒸水中或仅仅暴露于空气之中（两者均在室温下22℃左右进行）进行解冻。加入保护剂，可防止精子细胞内水分结冰后，体积增大撑破细胞膜。但在解冻过程中，有一半左右的精子细胞会死亡，原因很多，如精子细胞内冰晶融化时，胞内液体会和胞外保存液发生交换，如果进入细胞内的液体过多、过快，会破坏精子细胞。但是剩下的精子，如果活力良好，足够进行辅助生育技术。理论上，一个受精卵只需要一个精子，如果健康精子数量过少，可以选用显微注射法，将精子一个一个注入卵细胞中。

Answer 3

（一）精子的收集
　　禁欲期（通常为 3～ 5d）后，用手淫方法将精子收集于 10～ 20mL 无菌的聚丙烯样品收集容器中。要求禁欲期是为了更好地冷冻保存样品。通常而言，这样的精子与收集前禁欲期较短及不规则的精子相比，冷冻保存后的特性更恒定且更完善。

　　射出的精液是液态的，但正常情况下立即凝结成胶状。凝结后的精液通常在 30min内液化，此时就可测定其体积。为了使精子获得最大的冷冻存活力，应在收集精液后 1min内开始对液化精子进行冷冻保存处理。

　　（二）体积的测量

　　体积可用较准的加样器或带针头的 5mL 注射器来测量，有时也可根据收集精液前后采样瓶的重量之差来计算。取 0.1～ 0.2mL 精液作精液分析（活动精子的百分数及其质量、精子密度等，参见本书有关章节），此外尚需取出一些精液，同时以用来做筛选某种性传染疾病的检测、进行某些检测以筛选导致性病的微生物如奈瑟淋球菌等（详见有关章节）。

　　（三）甘油化

　　甘油作为冷冻保护剂，可以分步方式直接加入到未经处理的精液之中。每次加入后混匀，时间间隔为 1min；或间接地作为扩张液或基液的组分，经稀释后逐步加入精液。而在美国与加拿大，40% 以上的著名精子库，仍单独使用甘油作为冷冻保护剂，而越来越多的新的精子库则使用扩张剂，尤其是含甘油的两性离子缓冲系统。

　　甘油化的条件不一定涉及温度的特殊条件（除了室温之外）和接触时间（除了加入甘油及混匀所需时间之外）。

　　（四）包装和存活力观察

　　甘油化的精液可吸入塑料吸管（可用封口剂，加热，或用尼龙塞来密封）或放入玻璃安瓿（用火焰封口），也可放入塑料冷冻管（冷冻小瓶）后用螺口盖拧紧。每份冷冻精液的体积通常是 0.4～ 0.8mL，这可作为人工授精的一个单位。当然如果合适，人工授精也可能使用一个单位以上的精液，选择用于冷冻保存精子的容器是很重要的。这种容器应是易于标记、操作、储存，同样也应具有很好的生物兼容性以及抗压性能。高质量的聚丙烯吸管或小瓶看来最符合这些标准，而没有易碎及被洗涤剂污染等玻璃容器所具有的缺点。

　　放入液氮冷冻之前，除了要对被冷冻和储备的精子进行分装以外，还需准备一份质量控制检测样品。对收集后未经处理的精液、用冷冻保护剂处理过的精液以及储存前、冻融后的精液均应观察其中的活动精子及其活动力。通过观察能追踪冷冻保存各阶段的精子生存情况，并能确保了解冷冻精子的存活能力。

　　（五）冷冻

　　吸管、安瓿中的精液冷冻保存时可分散或成组贮存，其位置保持垂直、水平或倾斜。通常是放在液氮气雾中，有时也可放在机械（电子）冷冻柜的冷冻气中。冷却和冷冻过程则可用人工以静态或逐步方式，也可用电脑控制的液氮供给系统来完成。最常用的是操作者利用液氮储存容器中的气相以直接一次性或逐渐方式进行冷冻。带有吸附液氮的石棉衬垫的生物干燥运送器，也能在气相中用于冷冻，然后在液相中转移到储存容器。

　　（六）储存

　　经分装的样品，均应贮存在金属容器内的液氮之中，而这些容器则应放置在适当的液氮冷冻箱之内。用以监视液氮水平面的装置［机械的和（或）电子的］是为了长期储存在高于液氮温度（ -196℃ ）的情况下防止丧失精子功能，监视水平面的常见机械（手工）方法是将一根带刻度的插杆垂直放入液氮底部后拔出，则在其上面就会形成一条霜线，以指示液氮水平面，至于各种复杂的局部和遥控电子警报系统现许多国家均已有市售。另一方面，少数精子库只使用闪烁灯定期用肉眼检查，AATB 的组织库标准只要求一个有效的监测程序，以确保样品始终储存在液氮表面之下。冷冻生物学家和有关研究人员，通过融解储存前样品，并进行检测，发现在冷冻刚开始期间精子活动力有某些丢失。然而以后储存在液氮表面之下-196℃ 的冷冻精子，活动力没有进一步丢失，人们已经证实癌症患者治疗前精液中的精子冷冻生存活动力往往是差的（解冻后精子活动力百分数降低），尽管如此，这降低了的运动能力在长期储存期间并不进一步降低。

　　在所调查的 42家 AATB 成员的组织库中，只有 2 家报道了精液［由正常供精者及（或）治疗前患者提供］长期保存期间精子活动力丧失的例子。另有报道只有 1 例冷冻保存 3 年后精子活动力丧失。可以为人们所接受的观点是，贮存过程中精子活动力丧失系冷冻前没有准确测定所致或更可能是由于没有确保最佳储存条件所造成的。

　　（七）解冻

　　将装有冷冻精子的包装盒暴露于空气或水中即可使冷冻精液恢复液态。通常暴露在室温，但也可暴露在其他温度下，这要根据各精子库设计的方法学而定。