Question

引物设计时如何添加酶切位点

Answer 1

1、添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求。

2、相邻的两个酶切位点不同时使用。在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相邻的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

扩展资料

保护碱基添加原则：

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

添加保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

参考资料来源：百度百科-双酶切

参考资料来源：百度百科-保护碱基

参考资料来源：百度百科-酶切位点

Answer 2

DNA合成，新链的延伸方向是5→3 因此，需要在5端加上酶切位点记得再加上一些保护碱基，因为内切酶除了有特异的识别位点之外， 还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来 保护碱基的具体数目一般5-6个。 引物的结构就应该是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列