Question

新手。。关于菌液pcr 。。还有什么不清楚我再补充。。 万分感谢！！！

我在做SSR引物筛选，其中有一步是转化克隆到大肠杆菌，然后做菌液PCR送去公司测序。问题出现在菌液PCR这里，我做2次pcr。一次pcr是3引物的（包括2个通用引物+1个微卫星引物）；另一次PCR是2引物的（只用2个通用引物），也就是通常所说的阳性对照。我现在P完以后，大多数是3引物的能P出条带，但是阳性对照却怎么也P不出来。
之前我做出来过一次，但是后来就一直很不理想。我排除了我操作过程中的步骤错误，或者试剂污染什么的，还是不行。我又请其他人，换了试剂，还是P不出、
能帮我解释下到底是什么原因么？
万分感谢！！！

Answer 1

如果排除操作、试剂及载体污染的话，那么你之前做的3引物菌P结果很可能是假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）。很好奇你挑选做菌P的克隆数量。建议你多挑几个克隆，同时在菌P时加入一组以一个通用引物一个卫星引物组成的上下游引物的试验。有兴趣的话还可以选择菌P结果比较好的菌液做个小抽，然后双酶切以证实是否阳性克隆。

Answer 2

我我也8知道...

Answer 3

你在搞什么呢？现在工作如何了？