Question

PCR的操作注意事项

Answer 1

实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
(1)戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。
(2)使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。
(3)避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。
(5)最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。
(6)操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。
(7)尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区。
(8)重复实验，验证结果，慎下结论。

Answer 2

PCR操作注意事项：1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg ,肾3-4μg,骨骼肌和脑组织1-1.5μg,胎盘1-4μg,上皮细胞8-15μg,成纤维细胞5-7μg