血球计数板的误差来源及避免方法
误差来源
1、镜检计数室。
因前一次清洗不到位，或者保存过程中存在污染，更或者因操作不当导致的计数室存在划痕，若不及时清洗或更换，则会对后期实验计数产生极大影响。
所以，在每次使用血球计数板之前都需要加一步镜检计数室，如若在镜检时发现计数室有污物，则需按要求清洗并吹干后再进行实验
2、摇匀后取液。
在吸出培养液进行计数之前，需轻轻震荡试管，使菌体分布均匀，防止聚沉淀，从而提高计数的代表性和准确性。
3、先盖血盖片后加菌液。
在菌悬液摇匀后，应先在血球计数板上盖上血盖片，再用滴管吸取少许菌悬液，从计数区中间平台沿血盖片的上边缘滴入一小滴菌悬液，利用液体的表面张力一次性充满计数区。
若先加菌液再覆盖血盖片，则容易因为菌液加入过多，而导致血盖片未与血球计数板支持柱接触，血盖片浮于菌液上方而导致最后计数偏大，同时会因为有气泡产生而导致计数偏小。
避免方法：
1、避免技术误差，纠正仪器误差。
所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。
2、缩小计数域误差及分布误差。
3、降低异常标本的干扰误差。
扩展资料：
血球计数板的优点：
利用血球计数板在显微镜下能直接数出每个小方格中的微生物的个体数目，根据该小格所占的体积，快速地推算出单位体积的溶液中含有的微生物总数。
血球计数板的缺点：
但若菌悬液中不加可以区分细胞死活的试剂时，计数通常计得的是活菌体和死菌体的总和（有时还有微小杂物），还有微小杂物也被计算在内，这样得出结果往往偏高，因此此法适用于体积较大的单细胞微生物的计数
参考资料来源：百度百科-血球计数板
1. 人工失误(混匀、加样、稀释、计算错误以及人工操作误差)
a. 在对5个操作者的观察中，操作错误和随机错误分别占3.12%和7.8%。
b. James M. Ramsey做了一项实验，衡量取样区和稀释系数如何影响计数的准确性。
他测试了3个取样区面积(18, 9和4 mm2)及两个稀释系数(1:100 和 1:25)。取样面积减小时CVs值是升高的，稀释倍数的升高会降低CVs。
c. Bane 发现，当同一个操作者去对同样的两份精液样品计数时，计数结果的差异55%归因于取样和移液问题， 45%归因于计数室和细胞计数问题 [5]。 Freund和Carol 展开的另外一项实验表明，不同操作者之间的计数差异能高达52%，而同一个操作者的计数差异为20%。
2. 多次计数以保证结果准确性的必要性
a. 1907年， John C. DaCosta 声明，为了得到精确的计数结果，很有必要取血液样品中的多滴血液分别进行计数.
b. Nielsen, Smyth和Greenfield得出结论， 为了得到10%, 15%和 20%的血球计数板计数准确性, ，必需的样品数分别为7份, 3份和2份,每份样品中分别包含180个, 200个和125个细胞[6]。
c. 1881年， Lyon 和Thoma推测血球计数板的标准误差为 ,其中n即计数的细胞数目；
d. 1907年, William Sealy以“学生”的名义发布了他计数酿啤酒师的酵母的工作，他特地通过实验和数学模型计算了计数误差，公式也为[7,8]。
3. 细胞均匀分布的要求
a. 1912年， James C. Todd将细胞分布不均匀列为计数误差的问题来源。
b. 学生也说有两项主要的计数误差来源，一为吸取的酵母样品不能够代表原液的浓度，另一个是随机取样时细胞在计数区域分布不均匀。
c. 1947年, 一篇文章提到血球计数板中的细胞浓度分布不均匀问题。最初的结果显示，离进样口最近和最远区域的浓度分别比平均浓度低3.5%和高3.5%。
4. 仪器及材料差异(栅格，深度，盖玻片，缓冲液类型以及移液器)
a. 结果显示计数室的计数误差和移液器（CV%）造成的计数误差分别在大约4.6% 和4.7%。
b. 在一项5个计数人员的计数实验中，移液器和血细胞计数器造成的误差分别为9.46% 和4.26%。
c. 1961年, Sanders和Skerry得出结论，盖玻片的位置能造成7.6%的计数差异。
d. 在关于不同稀释步骤的计数实验中，随着稀释步骤的增加，变异系数升高，每个血细胞计数系统的误差如下： Bürker-Türk (BT) (7.7%-12%), Thoma (6.6%-14.1%), Makler (19.8%-23.6%)。
血球计数板的误差避免方法
人工操作误差 - 为了解决这个问题，自动化和机器人技术能够代替人工的样品操作和计数操作。.
加样误差 - 取样区越多、计数细胞越多，随机误差越小，但是需要时间越多。通过应用自动取样或者成像技术，成千上百万的细胞能在很短时间内被分析，提高了效率，并把分析中的随机误差降到最低。
移液和稀释误差 - 这些取决于操作者的操作经验。通过采用自动加样器或者自动液流系统，这个误差可以被降到最低。
材料误差 - 计数室的误差是由于不同品牌的血球计数板或者同一品牌不同批次间的差异造成的。这也可以通过自动细胞计数仪（细胞计数仪的选择，请查阅http://dakewe.com/product/view/id-71.html或百度文库http://wenku.baidu.com/view/f13faf4916fc700abb68fc54.html 中《细胞计数仪的选择》一文）增加取样量及减小随机误差来解决。
细胞分布不均匀 – 血球计数板不合适的清洗，或者盖玻片放置不正确将会产生误差。这些可以通过不使用计数室的细胞计数仪来消除，比如流式细胞仪。但是细胞样品中若是存在细胞团，基于液流计数的仪器将很难计数，而使用图像计数仪，细胞团可以使用图像分析算法计数聚集的细胞，这样可以提高细胞计数的准确性。
参考文献：
http://www.biomart.cn/experiment/430/488/707/206434.htm
血球计数板计数误差的来源：
1. 人工失误(混匀、加样、稀释、计算错误以及人工操作误差)
a. 在对5个操作者的观察中，操作错误和随机错误分别占3.12%和7.8%。
b. James M. Ramsey做了一项实验，衡量取样区和稀释系数如何影响计数的准确性。
他测试了3个取样区面积(18, 9和4 mm2)及两个稀释系数(1:100 和 1:25)。取样面积减小时CVs值是升高的，稀释倍数的升高会降低CVs。
c. Bane 发现，当同一个操作者去对同样的两份精液样品计数时，计数结果的差异55%归因于取样和移液问题， 45%归因于计数室和细胞计数问题 [5]。 Freund和Carol 展开的另外一项实验表明，不同操作者之间的计数差异能高达52%，而同一个操作者的计数差异为20%。
2. 多次计数以保证结果准确性的必要性
a. 1907年， John C. DaCosta 声明，为了得到精确的计数结果，很有必要取血液样品中的多滴血液分别进行计数.
b. Nielsen, Smyth和Greenfield得出结论， 为了得到10%, 15%和 20%的血球计数板计数准确性, ，必需的样品数分别为7份, 3份和2份,每份样品中分别包含180个, 200个和125个细胞[6]。
c. 1881年， Lyon 和Thoma推测血球计数板的标准误差为 ,其中n即计数的细胞数目；
d. 1907年, William Sealy以“学生”的名义发布了他计数酿啤酒师的酵母的工作，他特地通过实验和数学模型计算了计数误差，公式也为[7,8]。
3. 细胞均匀分布的要求
a. 1912年， James C. Todd将细胞分布不均匀列为计数误差的问题来源。
b. 学生也说有两项主要的计数误差来源，一为吸取的酵母样品不能够代表原液的浓度，另一个是随机取样时细胞在计数区域分布不均匀。
c. 1947年, 一篇文章提到血球计数板中的细胞浓度分布不均匀问题。最初的结果显示，离进样口最近和最远区域的浓度分别比平均浓度低3.5%和高3.5%。
4. 仪器及材料差异(栅格，深度，盖玻片，缓冲液类型以及移液器)
a. 结果显示计数室的计数误差和移液器（CV%）造成的计数误差分别在大约4.6% 和4.7%。
b. 在一项5个计数人员的计数实验中，移液器和血细胞计数器造成的误差分别为9.46% 和4.26%。
c. 1961年, Sanders和Skerry得出结论，盖玻片的位置能造成7.6%的计数差异。
d. 在关于不同稀释步骤的计数实验中，随着稀释步骤的增加，变异系数升高，每个血细胞计数系统的误差如下： Bürker-Türk (BT) (7.7%-12%), Thoma (6.6%-14.1%), Makler (19.8%-23.6%)。
血球计数板的误差避免方法
人工操作误差 - 为了解决这个问题，自动化和机器人技术能够代替人工的样品操作和计数操作。.
加样误差 - 取样区越多、计数细胞越多，随机误差越小，但是需要时间越多。通过应用自动取样或者成像技术，成千上百万的细胞能在很短时间内被分析，提高了效率，并把分析中的随机误差降到最低。
移液和稀释误差 - 这些取决于操作者的操作经验。通过采用自动加样器或者自动液流系统，这个误差可以被降到最低。
材料误差 - 计数室的误差是由于不同品牌的血球计数板或者同一品牌不同批次间的差异造成的。这也可以通过自动细胞计数仪，增加取样量及减小随机误差来解决。
细胞分布不均匀 – 血球计数板不合适的清洗，或者盖玻片放置不正确将会产生误差。这些可以通过不使用计数室的细胞计数仪来消除，比如流式细胞仪。但是细胞样品中若是存在细胞团，基于液流计数的仪器将很难计数，而使用图像计数仪，细胞团可以使用图像分析算法计数聚集的细胞，这样可以提高细胞计数的准确性。
似，否则最终计数值偏高
2.样品稀释倍数。样品稀释倍数要适中，太少，细胞过于密集重叠，不易计数；太多，细胞过于分散，偶然误差过大，计数不准。一般每个格子10~20个为宜。
3.单次实验的偶然性。一般要做3次重复，得到数据后取平均值。
4.菌悬液未搅拌均匀。细胞溶液必须均匀，再用之前要震荡均匀，否则细胞沉在
试管底部，容易出现误差。
5.加样时计数室中存在小气泡。
