Question

【科研】PCR引物设计原则

Answer 1

引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。引物设计有两个主要考虑因素：特异性和扩增效率。特异性是由错配的频率决定的，特异性差的引物易产生错误的扩增产物。扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物达到理论最优的能力。
遵循原则如下：
1. 引物长度：引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25-35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。引物过短，会降低产物的特异性，每增加一个核苷酸，引物特异性可以提高 4 倍。引物过长，会使退火过程不完全，与模板结合不充分，以至引起扩增产物的明显减少。
2. 引物末端： 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；引物 3’端应避免出现发夹结构。
3. 引物G+C：含量 引物的GC含量控制在40%-60%之间。
4. Tm值：引物额外附加序列，即与模板非互配对序列，不应参与引物 Tm 的值计算；正向引物和反向引物的Tm值相差不超过5℃为佳，Tm值调整至55℃ -65℃为佳。
5. 碱基的分布：引物 A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；避免连续出现4个及以上的相同碱基，或者某两个核苷酸连续重复出现（例如，ACCCC或ATATATAT；引物内部或者两条引物之间避免有5个碱基以上的互补序列；两条引物的 3’端避免有3个碱基以上的互补序列。
6. 序列特异性：引物设计完毕请使用 NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。注意: PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。

Answer 2

① 特异性：引物应在保守区内设计并具有特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

② 引物长度： 一般在15~30碱基之间 ，引物有效长度Ln=2(G+C)+A+T，Ln值不能大于38。（Ln>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度74℃，不能保证产物的特异性）

③ 目的片段二级结构：要扩增的片段单链不能形成二级结构，扩增片段长度为100~600碱基对。

④ 引物二级结构：引物自身连续互补碱基不能多于3bp，一对引物间连续碱基的同源性或互补性不能多于4bp。

⑤ 引物的5′端：可以被修饰而不影响扩增的特异性。5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点；插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。

⑥ 引物的3′端： 绝对不能进行任何修饰，3′端也不能有形成任何二级结构的可能 ，引物3′端不要终止于密码子的第3位。

⑦ TM值：按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为50~70℃。 尽可能保证上下游引物的Tm值一致 ，一般不超过 2℃。若引物中的 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。退火温度约为TM-4。

⑧ GC含量：G+C含量在40%~60%之间。四种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。