Question

纯化蛋白质的方法

Answer 1

纯化蛋白质的方法有：沉淀、电泳、透析、层析、超速离心等。

1、沉淀。

2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。

3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

4、层析：
a、离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b、分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。

5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。

纯化蛋白质的注意事项：

1、为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。
3、为了避免蛋白质的氧化，将0.1～1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇）加入到缓冲溶液中。
4、为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将1～10mmol/LEDTA金属螯合剂加入。
5、为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。
6、尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7、蛋白浓度不要太稀。
8、除非是进行聚焦层。否则pH需要合适，防止所使用的缓冲溶液pH与pI相同，使蛋白质的沉淀得以避免。
9、使用蛋白酶抑制剂，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将DNA酶加入来使得DNA降解，避免DNA对蛋白的污染。