Question

质粒DNA的小量制备 注意哪些操作 为什么

Answer 1

质粒DNA的小量制备注意事项：

1. 如有必要，在酶切反应液中加人1 μl 10 mg/ml RNA酶溶液（不含DNA酶）以去除污染的RNA。

2. 在使用前,在溶液Ⅳ（洗涤液）加入40ml无水乙醇,然后在瓶盖上作好记号。
   

3. 溶液Ⅱ（lysis buffer）在温度较低时，可能会产生沉淀,需先用水浴加热溶解，混匀后再使用.溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。
   

4. 最后加水溶解质粒时，可先将水加热,提高溶解度。

质粒DNA的小量制备的步骤：

1. 细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。必要时可以离心2次。 

2. 将细菌沉淀重悬于150μl用冰预冷的溶液I中，加入1/50体积RNAseA贮存液，剧烈振荡，使之完全分散。 
   溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0) 
   不含dna酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分装贮存 
   注：（1）溶液I高压蒸气灭菌后，贮存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；但提取大于15kb的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；（3）务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分；（4）震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提高效率；（5）配制RNaseA贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；（6）溶液I每2个月重新配制1次。 

3. 加200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀。 
   溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS 
   注：（1）若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；（2）不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA；（3）每2个月重新配制1次。 

4. 加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻微震荡混匀 
   溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml 
   注：（1）所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；（3）每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。 

5. 12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。 

6. 加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈震荡混匀。 

7. 12000g离心5分种，将上层液体转移到另一离心管中。 
   注：为了保证不吸出下层液体，可以先离心30秒，然后将上层与少量下层液体吸至另一离心管，离心5分种，再转移上层液体。切勿混入下层液体。 

8. 加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。12000g离心5~10分钟，小心吸去上清液。 
   注：（1）沉淀即为质粒DNA；（2）为确保质粒完全沉淀，异丙醇的体积可以适当加大至62~65%。 

9. 0.8ml70%乙醇洗涤DNA沉淀后，小心地吸去上清。在空气中静置3~10分钟，待沉淀干燥后，溶解于50μl高压灭菌的水中。 
   注：为洗涤充分，可以洗2次。 

10. 取1~2μl样品测定紫外吸光度，对所得质粒进行定量并了解其纯度，或取1~2μl样品进行琼脂糖电泳，估计其纯度和得率。