Question

【跪求】我的PCR体系应该怎么设定？退火温度？

我做一种真菌的pcr，引物序列左：aatcgacccgtttccgcctt，
右：gttagattgaccgcgattcc，生工合成单给的退火温度分别是59.85和57.8
我的25微升体系：10*buffer（含镁） 2.5
dntps 0.5
引物分别 0.5
DNA模板 1
rTaq 1U
1%琼脂糖电泳，结果DL2000和二聚体都很亮，就是没有特异性条带，请问各位大侠，我那里出了问题，退火温度，我降低5度还是没有，请问引物多和模板多，是否影响结果，镁离子是否要单加，朋友给我找找原因，我摸索2月没有结果了！

Answer 1

根据你描述，体系可能性不大。所以给如下建议：
1. 检查引物，确保正反向设计没有问题，而且最后都是从5到3顺序书写并送交合成（这种错误很低级，但有人犯过，所以提醒，如果自己不很保证就让别人把把关）。
2. 再次要求生工合成引物（合错可能性有，不大），或者重新换位置设计引物
2. 由于是真菌，你用基因组还是cdna做模板？倘若后者要考虑你cdna质量是否够好。前者，那么可能内含子太多你pcr延伸时间不够？
3. 尝试温度梯度pcr
4. 尝试热启动pcr（特殊热启动酶，或者待遇变形快要结束时再加入taq）
5. 可以考虑用不含有mg的buffer，然后可以做mg梯度pcr

Answer 2

感觉你的上下游引物cg含量都很高啊。
你从55度到65度做一个温度梯度试试。
模板稀释到在琼脂糖上看不出来的浓度。

也可以去这里问问。
http://bbs.bioon.com/bbs/forumdisplay.php?fid=149

Answer 3

用Touch Down PCR试试， 还有你确定你的模板没有问题么？ 可以尝试增加模板量，延长变性时间。

Answer 4

我觉得可能出问题的地方有：
1.我一般用50微升体系，dNTP要用4微升，你的dNTP用量太少了
2.引物量太多，你的体系加0.3微升引物就足够了，你加多了会形成引物二聚体
3.退火温度要比TM值低一些
4.检查你的Taq酶是否还有活性
5.最后模板也检查一下，别太着急了，每个因素都要考虑到哈