Question

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点，图1中Cmlr表示

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点，图1中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因．请回答下列问题：限制酶MspⅠBamHⅠSmaⅠHpaⅡKpmⅠ识别序列及切割位点CC↓GGGG↑CC G↓GATCCCCTAG↑G CCC↓GGGGGG↑CCCCC↓GGGGCCGGTAC↓CC↑CATGG（1）将提取的质粒与外源DNA分别加入缓冲液中，选用相应的限制酶处理时，影响处理效果的外界因素主要是等______（写出两点）．（2）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，能否使用MspⅠ与BamHⅠ同时切割质粒与外源DNA？答：______，原因是______．（3）可选用______、______限制酶同时酶切质粒与外源DNA，酶切并连接后可获得______种含目的基因的重组质粒，筛选含有该重组质粒的大肠杆菌时，需要在含______的培养基上培养．（4）研究发现当CCGG序列在X酶作用下，其内部胞嘧啶残基发生变化后，MspⅠ仍能识别并切割，但HpaⅡ则不能识别，而BamHI和SmaI对类似变化也十分敏感，KpnⅠ则不敏感．若在含有图1所示质粒和X酶的缓冲液中，同时加入KpnⅠ、HpaⅡ、MspⅠ和SmaⅠ并完全酶切后，则最可能得到______种DNA序列．（5）为了从基因文库中分离获取T1噬菌体抗性基因，将重组质粒导入对T1噬菌体敏感的大肠杆菌，然后将含有该大肠杆菌的菌液分别接种在预先涂有______的培养基上培养，从而初步检测目的基因的表达．

Answer 1

（1）酶的活性易受温度和PH的影响．
（2）由图可知，在质粒的两个标记基因中都有MspⅠ的切割序列，在目的基因中有BamHⅠ切割序列，所以不能使用MspⅠ与BamHⅠ同时切割质粒与外源DNA．
（3）MspⅠ与HpaⅡ会将质粒的两个标记基因都破坏，所以不能用这两种限制酶，BamHⅠ会将目的基因破坏，所以排除，可选用KpnⅠ、SmaⅠ同时酶切质粒和DNA．切割的目的基因片段，一端是平末端，一端是黏性末端，所以连接后可获得含有1种目的基因的重组质粒，切割使氯霉素抗性基因被破坏，新霉素抗性基因保持正确，所以培养基中含有新霉素．
（4）根据题意，加X酶后，MspⅠ仍能识别并切割，BamHI和SmaI对类似变化也十分敏感，KpnⅠ则不敏感，所以能酶切的MspⅠ和KpnⅠ，结合质粒中酶切位点可知，图中有两个MspⅠ酶切位点，1个KpnⅠ位点，同时1个SmaⅠ位点也能被MspⅠ酶切，所以共有4个位点，切割成4个片段．
（5）根据题意，为获取T₁噬菌体抗性基因，所以将大肠杆菌培养在含有T₁噬菌体的培养基中，敏感的大肠杆菌死亡，导入抗性基因的大肠杆菌存活．
故答案为：
（1）温度、PH 
（2）不能    MspⅠ会切割破坏质粒上的两个标记基因（或tet^R与amp^R基因），而BamHⅠ会切割破坏目的基因
（3）KpnⅠ、SmaⅠ1    新霉素
（4）4 
（5）T₁噬菌体