微生物实验中为什么细菌在染色前需要固定？
一：杀死细胞，是染料易于着色。
二：使细菌附着于玻片上，不易被水冲掉。
在固定时，是要慢慢晾干，如果得确要加快速度，可以处于酒精灯火焰上部远处稍微烘几下，切忌烘得玻片升温，否则有可能会破坏细菌生命形态
细菌的革兰氏染色与显微观察
一、 实验原理
革兰氏染色原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结，当用乙醇处理时，由于脱水而引发网状结构的孔径变小，通透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 显微镜成像原理：现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常 被称为复式显微镜。显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。在载玻片与镜头之间加滴镜油主要是为了增加照明亮度和增加显微镜的分辨率。以油代替空气作为光的传播介质，减少光线的折射或全反射，使观察到的像更加清晰。
二、 实验器材
1. 菌落：
大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、
金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物。
2. 溶液或试剂：
蒸馏水、碘液、结晶紫染色液、95%酒精、番红染色液、香柏油。 3. 仪器：
显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、镊子、擦镜纸。
三、 实验步骤
革兰氏染色：
1. 涂片
取出载玻片，点燃载玻片，燃尽载玻片上的酒精和灭菌，在中间轻轻点一小滴蒸馏水，用接种环在试管的斜面培养基上，轻轻挑取少量菌体，整个过程试管口都要处在酒精灯的上方，而且速度要快，以防污染培养基。然后在载玻片的小水滴以转圈的动作涂片，待水滴混浊后停住，等其干燥、固定。
2. 初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于菌落上，染色1～2min ，倾去染色液，有细水从载玻片上方向下冲洗，至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
3. 媒染
滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
4. 脱色
将载玻片上面的水甩净，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管加95%的酒精脱色，直至流出的酒精刚好不出现蓝色，立即用水冲净酒精，将载玻片上水甩净。
5. 复染
用番红液复染约1～2min，水洗，然后再吸水纸吸干
6. 镜检：
在低倍镜下寻找要观察的细菌菌落（在不停地移动载玻片，若感觉到有红色阴影，立刻停止，调整倍数，若不是菌落，继续找），将镜筒升高，然后转换到油镜。在样品区域加滴香柏油，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。
染色前固定的目的有三个：
1、杀死微生物，固定细胞结构。
2、保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。
3、改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。
固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
细菌染色的过程
1、涂片：临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。
2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。
3、固定：细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。
4、初染：不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。
5、媒染：通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。
6、脱色：此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。
7、复染：细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。复染液的颜色与初染液有明显不同。
微生物实验中细菌在染色前需要固定的原因：
一：杀死细胞，是染料易于着色。
二：使细菌附着于玻片上，不易被水冲掉。
在固定时，是要慢慢晾干，如果得确要加快速度，可以处于酒精灯火焰上部远处稍微烘几下，切忌烘得玻片升温，否则有可能会破坏细菌生命形态。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染1分钟。
3）蒸馏水冲洗。
4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，蒸馏水冲洗。干燥，镜检。
原理：染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
