Question

质粒抽提的抽提方法

Answer 1

质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。关于碱裂解法的原理，复旦大学生化与分子生物学实验室的网站有一篇专论，大家可以去看一下。这是一篇美文，非常有趣。文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点，也是非常有启发的。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了 (电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。)。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。 (似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是 100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能 100% 配对复性。) 碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。这个实验我们没有做过，但 QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法。