Question

试述x射线衍射检测蛋白质结构的原理

Answer 1

X晶体衍射。首先要得到蛋白质的晶体。 通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，工作便完成的80％，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。 所以x射线方法解析蛋白的瓶颈是摸索蛋白结晶的条件。 X射线衍射方向决定于晶体的周期或晶面间隔，但是，在周期相同或晶面间隔相同的情况下，由于晶胞内原子排布方式不同，则会造成衍射点强度不同。也就是说，衍射点强度的大小包含着与分子结构有关的信息。分子结构中所有原子对每一个衍射斑点的强度都有各自的贡献，因此，通过分析X射线衍射点的强度，可以得到有关晶胞内原子排布的信息。常用的晶体衍射强度的记录有两种方式。一种是将晶体所产生的衍射光束点记录在底片上，如经典的感光胶片，然后，用扫描仪阅读衍射强度。近年来发展起来的象板探测器，实际上是用象板取代了感光胶片，免除了显影、定影等麻烦。另一种方法是多丝正比面探测器，先将衍射光束光子信号转换为电子信号，再处理为衍射强度。还可以采用CCD技术，使数据采集精度和信号转换速度得到较大的提高。这非常重要，因为生物大分子晶体结构解析的分辨率和精度主要取决于晶体衍射数据采集的质量和精度。多波长反常散射法成为近年来发展较快的一种方法。生物大分子中通常含有金属离子或重原子，不同的原子对不同波长的X射线具有特征的反常散射效应。同步辐射光源具有强度高、单色性好、波长连续可调的特点，在进行生物大分子晶体衍射实验时，如果晶体中含有金属离子或重原子，则可以将同步辐射光源的波长调整到对应原子反常散射明显的位置，获得反常散射数据，从而进行晶体结构的解析。生物大分子的二级结构常常是螺旋结构（如蛋白质中的a螺旋和DNA的双螺旋），其特点是每一圈螺旋中(即每一周期)包含一定数量的、散射能力相同的结构单元。具有螺旋结构的生物大分子，其X射线衍射图有相应的特点。凡是衍射图上具有这些特点的物质，如纤维状蛋白质、DNA，其结构均为螺旋结构。利用从衍射图得到的衍射数据，可以分析出晶胞内三维空间的电子密度分布，确定结构模型。下面以肌红蛋白为例加以说明。肌红蛋白分子量为18000，含有153个氨基酸残基，分子中有1200个原子(不包括氢原子)。为了定出分子中所有原子的位置，需要测量大约20000个衍射点的强度并计算其位相角。第一阶段分析到6的水平，定出多肽链和正铁血红素的位置，其中棒状结构符合a-螺旋的特征，推算出a-螺旋约占残基总数的70%。进一步分析提高到2的水平，虽然不能定出每个原子的位置，但可以肯定分子的主要部分是由a-螺旋组成，而且是右手螺旋，链必须弯曲、盘绕。其中大约13~18个残基不是a-螺旋，一半以上的氨基酸残基能定出种类。再进一步分析到1.5的水平，可以完全弄清楚氨基酸排列顺序。这样，通过X射线衍射的研究，可以确定蛋白质一级、二级、三级结构。可见X射线衍射分析是研究生物大分子结构的强有力的工具。用X射线衍射技术分析分子结构时，一般有以下几个步骤：（1）用实验测定单个晶格的线度和从衍射图中测量衍射点的强度；（2）根据上述数据，结合其它方法推断原子排列，得到尝试结构模型，计算这种结构的衍射极大值，然后与实验观察值比较；（3）修正所提出的模型，直到计算结果和实际所得到的数据趋于吻合。X射线晶体学方法是测定蛋白质结构的主要方法。球状蛋白质是多肽链卷曲成团的蛋白质，它和纤维状蛋白不同，构型一般比较复杂。球状蛋白质分子量大，表面基团的构象不稳定，要获得有序排列的晶体是比较困难的。所形成的晶体不可能是完美的堆砌，而是会在分子之间形成许多大的孔或通道。这些通道常常由占晶体体积一半以上的溶剂分子所占有，而溶剂分子的绝大部分在晶体上又是无序的。晶体中的蛋白质分子之间仅有少量的区域发生接触，这些区域的相互作用也是较弱的相互作用，通常是通过一个或几个溶剂分子发生作用。蛋白质晶体的形成依赖于一些参数，如pH值、温度、蛋白浓度、溶剂的种类、沉淀剂的种类以及金属离子和某些蛋白的配基等。用X射线衍射图分析DNA的空间结构，出现螺旋结构的衍射图样，说明每一圈螺旋有10个重复结构单元，反映了分子间的排列情况。根据DNA的X射线衍射图结合其它技术，Watson和Crick提出了DNA的空间结构模型：两条多核苷酸链组成反平行的右手双螺旋，磷酸在外，碱基在内；螺距为34，每圈螺旋包含10个核苷酸，每个核苷酸轴长为3.4，螺旋直径为20；两条链之间形成氢键。