Question

如何看限制性内切酶的酶切结果

Answer 1

图片中的这个质粒长度为7338bp，其中含有1200bp的插入片段，现在我们使用两个限制性内切酶来切这个质粒，这两个限制性内切酶分别为HindII与BamHI，酶切的结果如下所示：

第一条泳道是DNA marker，范围是500bp到10000bp；

第二条泳道是没有切的质粒，作为对照，在这一条泳道中的质粒可能含有三种构象。
第一种是超螺旋，它结构致密，在凝胶中运动最快，我们可以看到这个片段。
第二种是含有切口的质粒，在质粒DNA复制过程中,拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口,解开质质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构，这种形式的质粒迁移速率介于超螺旋和线性DNA之间，这种片段可能有，也可能没有，也可能是与第一种混合在一起，不太容易看出来，总之，在把原始质当作对照时，原始质粒的电泳距离必然是最远的（此时我们不考虑切下的小片段）。
第三种是线性DNA，当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时,就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率最慢，质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。从图片中可以看到，这个片段中并不含线性DNA。

第三条泳道，双酶切的DNA片段，这个是经双酶后的大片段，应该是7338-1200=6138bp这个片段，它跑的没有原始质粒快，并且在最前面还有一条淡淡的1200bp的片段，这说明已经把这个质粒给切好了。

第四条到第五条泳道，这两条是单酶切的片段，跑得最慢，有的时候，我们仅仅需要单酶切就行了，此时就看它与原始质粒的对照，比原始质粒跑得慢，就可能判断被切开了。

参考资料：
https://blog.addgene.org/plasmids-101-how-to-verify-your-plasmid