Question

细胞的克隆形成，你必须要知道的事！

Answer 1

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0 .3-1.0mm之间。克隆形成是测定细胞增殖能力的有效方法之一。克隆形成率反映细胞两个重要性状：细胞群体依赖性、增殖能力。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般来说：

初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；

二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；

正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强；

成纤维细胞克隆形成能力弱，上皮细胞形成能力强。

一、平板克隆形成实验

主要适用于贴壁细胞。实验方法如下：

1、取对数生长期的单层培养细胞，用0.25% 胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在完全培养基中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每孔50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含六孔板中，必要时可设置2个平行，并用十字法混匀，使细胞分散均匀。置37℃，5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养14天，培养7天时可换液。

3、14天后，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加多聚甲醛固定30分钟。然后去固定液，加适量结晶紫染色液染30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率= (克隆数/接种细胞数)×100%。

二、软琼脂克隆形成实验——悬浮细胞

主要适用于贴壁细胞。实验方法如下：

1、双蒸水配制10ml的1.2% Argrose和0.7% Argrose，高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；

2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。

3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2% Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。

4、根据实验需要的量配制20% FBS+2×基础培养基。

5、铺下胶：按1:1比例使1.2% Argrose下胶和20%FBS+2×基础培养基混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔板，配5ml上述培养液+5ml 1.2% Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。

6、细胞计数：取对数生长期细胞，轻轻吹打，使之成为单细胞，活细胞计数，用培养基调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺104个细胞。

7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×基础培养基，一组细胞需先配2ml（20%FBS+2×基础培养基）+2ml 0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔板中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2-3 周。

8、间隔2天补加200ul 完全培养基，以防过于干燥。

9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数/所有克隆数×100%。每孔加入1ml的结晶紫染液，30min，镜下拍照。

1、接种时细胞密度适度，不可过高。

2、软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；

3、琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装；

4、细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响；

5、细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。

6、细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

我们从传统方法中不断吸取经验摒弃不足，Cas9X海星生物技术平台研发出了ClonePlus™技术。使绝大部分细胞克隆形成率达到90%以上，个别克隆形成能力较差的细胞例HepG2通过ClonePlus™技术也能够在短时间内稳定筛选出单克隆，而且克隆形成的时间可缩短到1-2周的时间，大大压缩了整个单克隆生长的时间周期，赢得宝贵的时间。