Question

做组织Western Blot，现在actin和目的蛋白都没有条带。可能是什么原因导致的 ？

近2周在做组织Western Blot，刚开始几天只有actin有条带而目的蛋白没有条带，现在actin和目的蛋白都没有条带。请教各位大神，可能是什么原因导致的
具体步骤：
1.配胶：5%分离胶和10%浓缩胶。
2.跑胶：
（1）电泳：1X电泳液，60-70v，约90分钟至mark分层，而后转为90-100v 约30分钟直到完成；
（2）转膜：1X转膜液，300mA，120分；
（3）封闭：5%脱脂奶粉封闭120分钟，摇床中进行；
（4）一抗孵育：4度，缓慢旋转过夜；
（5）TBST冲洗：1XTBST冲洗，10分钟*3次，摇床中进行，但我实际操作过程中经常每次可能15-20分钟。
（6）二抗孵育：常温，缓慢旋转中进行，持续120分钟；
（7TBST冲洗：1XTBST冲洗，10分钟*3次，摇床中进行，但我实际操作过程中经常每次可能15-20分钟，而后最后一次TBST冲洗会长达1-2小时；
（8）曝光：现配现用的显影液（A+B），

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Answer 1

转膜的时候转没了吧？