Question

PCR产物Tm值有哪些要求吗

Answer 1

　　纯化的pcr产物测序需要的要求：
　　(1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；
　　(2）必须进行胶回收纯化；
　　(3）DNA纯度在1.6-2.0之间，浓度50ng/ul以上。

　　方法
　　(1) 在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A，若需加入的Buffer PCR-A不足100μl，则加入100μl。
　　(2) 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步骤⑴中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。
　　(3) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm离心1min。
　　(4) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube 中，加入700μl 已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。
　　(5) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。
　　(6) 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30μl Eluent或去离子水（65℃预热）。 (7) 室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。 (8) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。