Question

中量质粒提取步骤

Answer 1

操作步骤

( 请自备 50mL 离心管、20mL 离心管、异丙醇、70%乙醇)

1. 取 50mL 菌液，置于 50mL 离心管中，4000rpm 4℃离心 5 min，彻底弃除上清。

2. 加入 20mL 溶液 A，充分振荡 2min，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。4000rpm 4℃离心 5min，彻底弃除上清。

3. 加入 2mL 溶液 I 和 40μL 溶液 B，充分振荡 2min，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。

4. 加入 4mL 溶液 II，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀 6 次，注意整个管子的内表面均需与溶液 II 接触，室温放置至溶液清亮。（一般为 4-5min，

如 5min 后溶液未变清亮，说明细菌过多，应考虑减少菌液量。注意混匀手法要温和，不要剧烈混合）

5. 加入 3mL 溶液 III，盖紧管盖，立即轻轻颠倒混匀 8 次，4℃放置 5min。（此步注意要尽快混匀，但手法要温和）

6. 10000rpm 4℃离心 15min，小心吸出上清，轻移至新的 20mL 离心管。（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀悬浮）

7. 加入 6mL 异丙醇，充分混匀，室温放置 10min。

8. 10000rpm 室温离心 15min，小心吸弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，吸去残余的液体。（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀

悬浮）

9. 加入 3mL 70%乙醇，温和震荡 30Sec，10000rpm 离心 10min，轻轻弃去上清。

10. 重复步骤 9，倒置于干燥的吸水纸上 2min。

11. 将离心管敞口室温放置 5min，晾干沉淀。

12. 加入 100μL 溶液 IV，温和震荡 2min，使沉淀完全溶解。

注意事项：

1、 溶液 II、溶液 III 如出现结晶或者沉淀，可在 37℃水浴中加热几分钟溶解，直至液体恢复澄清。

2、 提取的BIOG质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 如所提质粒为低拷贝质粒或者大于 10kb 的大质粒，应加大菌体

使用量，同时按比例增加溶液 I、溶液 B、溶液 II、溶液 III 的用量。