Question

细菌16S微生物多样性研究实验方法及关键点

Answer 1

1. 样品元基因组提取

1.1 样品元基因组抽提核心思想：

尽可能多的获得样本中各种微生物的基因组DNA。

1.2 样本元基因组提取的重要性：

最大程度获得样本中各种微生物的基因组DNA，为后续样本的分析和比较提供完整的微生物种类及丰度信息。否则，分析环节“形同虚设”，永远分析不出真实结果。

1.3 对样品的一些思考：

a）样本收集的难易程度；

b）样本的珍贵程度；

c）怎样用尽可能少的单个样本使用量来帮助客户完成研究目的；

d）怎样在实验开始前就确保客户结果的准确性；

e）复杂环境中的样本基因组如何能够更全面的获取。

1.4 元基因组提取的主要原理（核心步骤）：

①通过高温化学裂解法和物理击打法充分裂解细胞； 

②离心法除去杂质、抑制物等；去除破碎细胞中的蛋白质；

③纯化DNA； 

④消化RNA。

1.5 元基因组提取的主要流程：

1）样品准备：

样本-80℃保存；

避免样本出现反复冻融，影响样本中微生物组成，样本均在冰盒或干冰上完成拿取和转移。

2）化学裂解+物理击打

I.化学裂解：

作用：采用化学方式破坏细胞膜和细胞核膜充分释放细胞内容物。

II.物理击打：

作用：针对细胞膜难以裂解或裂解不充分的微生物，采用玻璃珠碰撞产生剪切力进行物理干预破坏；

材料：玻璃珠。

3）酚类及生物碱干扰物的去除

PVPP：

作用：

a）去除酚类和生物碱； 

b）可参与配制适合的缓冲溶液反复浸提体系中的DNA，同时吸附杂质。

4）蛋白质、杂质、抑制剂干扰物的去除

HTR等试剂

纯化DNA；

Rnase A 消化RNA；

获得DNA溶液；

2. PCR文库扩增

2.1 高保真pfu酶的使用：

作用：

①降低扩增环节碱基错配率； 

②校正作用； 

③保真性大于Taq酶； 

④产生平末端。

2.2 最低循环数的控制：

a）循环数对PCR扩增的影响：

    1）降低扩增环节碱基错配率；

    2）校正作用；

    3）保真性大于Taq酶；

    4）产生平末端。

b）解决方法：

    1）根据样本来源及类型，利用预实验对扩增反应条件进行摸索，用最低的循环数获得满足后续实验浓度要求的扩增产物。

    2）因样本间存在质量差异等情况，应保持每个样本扩增的循环数统一。

c）扩增DNA模板浓度的均一性

    根据样本类型和来源，将扩增时样本DNA浓度调整至一致，以免由于样本DNA浓度差异造成扩增后产生偏差，增加样本间的可比性。

d）建库扩增循环数

    1）采用扩增形式进行接头添加；

    2）利用最低循环数确保完成建库。

3.实验过程质控

3.1 阴、阳性对照设置

1）元基因组提取环节：

①设置阳性对照，监控提取效果； 

②设置阴性对照，监控提取流程。

2）PCR环节：

①设置阳性对照，监控扩增效果； 

②设置阴性对照，监控PCR操作流程； 

③扩增抽提环节阴性对照，监控抽提是否有污染； 

④扩增抽提环节阳性对照，验证抽提效果。

4.数据分析优先级的确定

4.1 下机数据分析优先级：

1）分析阳性对照：观察实验、测序环节是否有问题；

2）比较分析不同测序run之间的阳性对照，排除测序批次间的差异性。

3）按照要求分析该批次中的样本。