Question

慢病毒真核表达载体动物模型的建立

本人想构建某基因的siRNA慢病毒真核表达载体。通过此载体抑制大鼠肝脏内相关物质的表达。
问题在于，何种通过何种途径可使慢病毒在大鼠肝脏内达到较高的转染效率？原计划载体构建成功后，将其通过腹腔注射的方式再经门静脉吸收入肝，此种方法可行否？另外腹腔注射时是采取多点注射吗？哪些点位？可否直接经门静脉注射？或有没有更为有效的方法？
还有就是，文献报道慢病毒载体转导时肝脏非实质细胞的效率要优于实质细胞。可调控否？让它在实质细胞也有很好的效率？

问题太多了，望高手们帮我解答，查了一周的资料了，毫无进展。谢谢诸位老师和同行了!
文献上说可以经尾静脉注射的途径，通常用于肝脏的转染，腹腔注射则多用于胃肠道、脾，胰腺的转染。
其实想了想可以不考虑非实质细胞的问题，对于我的实验（肝细胞再生）只要保证实质细胞的效率就可以了。
还是懵懵懂懂的，望德高望重的前辈们能指点一下。
ps：知道是为了解惑，而不是单纯的为了赚积分，回答的文不对题（这四个字用的是比较客气的）的毫无意义。就算非要CtrlV不如V点有用的过来。知之为知之，不知为不知。赚积分，没什么意思。知道在这点的设计上其实不太合理。

Answer 1

二、选择题：每题1.5分，共45分。答案一律写在答题纸上。
1、对细胞的概念，近年来比较普遍的提法是：有机体的 。
A、形态结构的基本单位 B、形态与生理的基本单位
C、结构与功能的基本单位 D、生命活动的基本单位
2、支持线粒体来源于细胞内共生细菌的下列论据中哪一条是不正确的。
A、线粒体具有环状DNA分子 B、能独立进行复制和转录
C、具有80S的核糖体 D、增殖分裂方式与细菌增殖方式相同
3、流式细胞术可用于测定 。
A、细胞的大小和特定细胞类群的数量 B、细胞中DNA，RNA或某种蛋白的含量
C、分选出特定的细胞类群 D、以上三种功能都有
4、SARS病毒是
A、DNA病毒 B、RNA病毒 C、类病毒 D、朊病毒
5、在caspase家族中，起细胞凋亡执行者作用的是
A、caspase 1，4，11 B、caspase 2，8，9
C、caspase 3，6，7 D、caspase 3，5，10
6、不能用于研究膜蛋白流动性的方法是 。
A、荧光抗体免疫标记 B、荧光能量共振转移
C、光脱色荧光恢复 D、荧光标记细胞融合
7、 不是细胞膜上结构。
A、内吞小泡 B、有被小窝 C、脂质筏 D、微囊
8、受体的跨膜区通常是 。
A、α-螺旋结构 B、β-折叠结构 C、U-形转折结构 D、不规则结构
9、现在 不被当成第二信使。
A、cAMP B、cGMP C、二酰基甘油 D、Ca++
10、 的受体通常不是细胞膜受体。
A、生长因子 B、糖皮质激素 C、肾上腺素 D、胰岛素
11、酶偶联受体中的酶不包括 。
A、丝氨酸/苏氨酸激酶 B、酪氨酸激酶
C、丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶 D、酪氨酸磷酸酯酶
12、在蛋白质分选过程中，如果一种多肽只有N端信号序列而没有停止转移序列，那么它合成后一般进入到 。
A、内质网腔中 B、细胞核中 C、成为跨膜蛋白 D、成为线粒体蛋白
13、线粒体是细胞能量的提供者，它在 。
A、同种细胞中数目大致不变 B、同种细胞中数目变化很大
C、不同种细胞中数目大致不变 D、同种细胞中大小基本不变
14、线粒体通过 参与细胞凋亡。
A、释放细胞色素C B、释放Ach E C、ATP合成酶 D、SOD
15、哺乳动物从受精到成体过程中DNA甲基化水平的变化是：
A、去甲基化 B、去甲基化-重新甲基化
C、去甲基化-重新甲基化-去甲基化 D、去甲基化-重新甲基化-维持甲基化
16、不参与蛋白质最初合成的是 。
A、信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）
B、停泊蛋白（docking protein）
C、易位子（translocon）
D、停止转移蛋白（stop transfer sequence）
17、内质网中含有的 可以识别不正确折叠的蛋白并促使其冲洗折叠。
A、Bip蛋白 B、Sec61蛋白 C、钙结合蛋白 D、蛋白二硫键异构酶
18、 的表达是哺乳动物细胞通过G1期检查点的重要条件。
A、Cyclin A B、Cyclin B C、Cyclin C D、Cyclin D
19、将血清从处于S期的原代细胞的培养液中去除后，细胞将停在 。
A、S期 B、G2期 C、M期 D、G0期
20、激光扫描共焦显微术的特点是能 。
A、进行光学切片 B、进行激光切割 C、检测自发荧光 D、产生微分干涉差
21、冰冻蚀刻技术主要用于 。
A、电子显微镜 B、光学显微镜 C、原子力显微镜 D、隧道显微镜
22、成熟促进因子（MPF）不能促进 。
A、卵母细胞成我为卵细胞 B、卵巢发育
C、G2向M期转化 D、蛋白质磷酸化
23、联会复合体（synaptonemal complex）见于 。
A、神经突触 B、胞间连接 C、多线染色体间 D、同源染色体间
24、人造微小染色体（artificial minichromosome）通常有①自主复制DNA序列 ②着丝粒DNA序列 ③端粒DNA序列 ④rRNA序列：
A、①②③④ B、①②④ C、①②③ D、②③④
25、组蛋白的修饰通常有①甲基化②乙酰基化③磷酸化④ADP核糖基化等修饰形式。其中会影响基因的转录活性的有：
A、①②③④ B、①②④ C、①②③ D、②③④
26、下面哪个实验方法不能告诉你基因的表达与否：
A、Southern杂交 B、Northern杂交
C、Western印迹 D、免疫荧光法
27、人们推测RNA是生命起源中最早的生物大分子是因为 。
A、细胞中有大量的RNA
B、RNA具有信息载体和酶催化功能
C、RNA没有DNA和蛋白质稳定
D、RNA具有调空基因表达的功能
28、活性染色质不具有如下哪一特性：
A、甲基化程度高 B、H2B的低磷酸化
C、很少有组蛋白H1与其结合 D、组蛋白乙酰化程度高
29、关于DNA结合蛋白（DNA binding protein）与DNA作用的论述哪一个是不恰当的。
A、识别信息来源于DNA顺序本身 B、识别位点存在于DNA双螺旋大沟
C、形成蛋白二聚体或四聚体 D、主要靠氢键和离子键
30、从胎儿肺得到的成纤维细胞可在体外条件下传50代，而从成人肺得到的成 纤维细胞可在体外条件下传20代，这主要是因为：
A、胎儿的肺成纤维细胞没有完全分化
B、体内细胞生长环境在胎儿和成人不同
C、成人的肺成纤维细胞受到凋亡因子的影响
D、细胞增殖能力是受细胞年龄限制的
三、简答题：每题5分，共25分。答案一律写在答题纸上。
1、 什么叫单克隆抗体，其主要特点是什么？
2、
教科书上往往可见到用类似的示意图来说明膜蛋白在膜上的分布。上述5种
形式中那些是目前尚未发现有科学根据的，为什么？
3、 内质网和高尔基体都是细胞内的膜结构细胞器，它们功能上的主要区别是什么？
4、 处于有丝分裂中的贴壁培养细胞常变成球形，随着M期的完成又逐渐贴壁摊平。另一方面，死细胞或即将死亡的细胞也会变成球形。用某药物处理HeLa细胞16小时后，有近40%的细胞变圆，而空白对照中只有约5%的细胞变圆。请用实验证明该药物引起的是哪一种变化。
5、某实验室分离纯化了一个DNA甲基化转移酶，当用裸露的DNA做底物时，几乎测不到甲基转移酶活性。当在反应体系中加入组蛋白H2A，H2B，H3和H4后，测到了明显的甲基转移酶活性。你认为该实验结果中，甲基转移酶活性升高的原因是什么？你将用什么实验证你的推理？
四、问答题：每题10分，共50分。答案一律写在答题纸上。
1、和细胞相比，为什么说病毒是非细胞形态的生命体。
2、细胞膜穴样内陷（caveolae）和网格蛋白有被小窝（clathrin-coated pits）是细胞膜上两类不同的膜结构，前者主要有内陷素（caveolin）后者主要是网格蛋白（clathrin）为其主要结构蛋白。前者直径为50-100nm，后者直径在150nm以上。两者膜脂的成分也不同，前者主要是胆固醇和鞘脂类，后者主要是甘油磷脂类。由于膜脂的成分不同，它们在不同去垢剂中的可溶性也不同。这些都是通过研究得到的结果。 现在你得到了蛋白质A，它分布于上述膜上的囊状结构中，请你设计至少两种实验证明蛋白质A到底是分布于哪种膜结构中。
3，某人在工作中意外受到一次有致癌可能性的放射性辐射，但并非由于本人操作不当所致。事后三个月被发现患有肠癌且已发展为晚期。为此他提出诉讼，要求单位赔偿。从细胞生物学角度你认为他会胜诉吗？为什么？
4、温度敏感型（ts）突变体是研究单倍体酵母细胞周期调空机理的重要手段，它使得能阻滞细胞周期进行的突变表型只在较高的培养温度（如35℃）才表现出来，而在较低的温度下（如20℃）则表现为野生型。某人筛选到两株ts突变体，在35℃时均表现为细胞增殖停止。为了解细胞周期阻滞的位置，他利用能将细胞阻滞在S期的药物羟基脲进行如下实验：
（1）他把一部分养在20℃的突变体A转移到35℃培养2小时以产生突变表型，而这也差不多是酵母细胞周期的长度。然后他再把酵母转移到含羟基脲的培养液中在20℃培养。他在不同时间取样用显微镜观察，未见到细胞发生分裂，相比之下一直培养在20℃的那些细胞在羟基脲中却能观察到一轮明显的细胞分裂。然后他又改变了实验顺序。这次他先把20℃培养的细胞用羟基脲处理2小时，然后再转移到不含该药物的培液中在35℃培养，这时他能观察到一轮细胞分裂。
（2）他用突变体B做相同的实验，则在两种情况下都看不到细胞分裂，而一直养在20℃的对照样品则能分裂。
问：（1） 突变体A和B在35℃会分别阻滞在细胞周期的什么位置？说明理由。
（2）你能推测ts突变体对温度敏感的原因吗？
检验细胞衰老（cellular senescence）的方法是看细胞是否仍然保持增殖的能力细胞衰老快，其寿命（life span）短；细胞衰老慢，其寿命长。其学生用遗传学的方法筛选到属于两个通路中A、B、C、D、E五个不同基因。A、B、C中的任何一个突变使细胞寿命短于野生型；A突变细胞的寿命与B突变细胞的寿命相似；A或B突变细胞的寿命短于C突变细胞的寿命。D或E的突变使细胞寿命长于野生型，但程度不同。
（1） 如果实验结果是：A和B同时突变细胞的寿命与A或B单独突变细胞的寿命相似。A和C同时突变细胞的寿命短与A或C单独突变细胞的寿命。那么，试问B和C同时突变细胞的寿命与A、B或C单独突变细胞的寿命相比是长了还是短了？为什么？
（2） 如果实验结果是：在B突变的细胞中过量表达A，细胞的寿命与B单独突变细胞的寿命相似。试问A基因和B基因的上下游关系是什么？
（3） 如果实验结果是：在A突变的细胞中过量表达B，细胞的寿命与野生型细胞的寿命相似。试问A基因和B基因的上下游关系是什么？
（4） 现在需要了解D或E基因对细胞寿命的影响是否依赖B，你将设计什么实验回答该问题？