Question

简述PCR技术操作步骤

Answer 1

原理：

DNA聚合酶链式反应技术简称PCR技术，是一种以模板DNA为基础，在引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合酶的酶促反应，完成对模板的目的片段的快速扩增的过程。

步骤为：

(1)变性：双链DNA在94℃条件下，通过热变性使模板的双链DNA氢键断裂变成单链。

(2)复性：当变性温度突然降至引物Tm值(通常为35～65℃)以下时，会使引物与模板DNA互补序列杂交。由于引物一般由10～25个碱基序列，模板DNA结构远比引物分子复杂，且反应体系中引物分子的浓度又远大于模板DNA，故在退火温度时，引物与模板DNA容易结合形成互补链。

(3)延伸：在DNA聚合酶的作用下，以DNA为模板和以4种脱氧核糖核苷酸为原料，在Mg2+存在的条件下。DNA聚合酶依赖于其5'→3'的聚合酶活力，以引物结合于DNA模板链为起始点。使引物的序列得以延伸，合成模板DNA的互补链。