Question

降落PCR的注意事项

Answer 1

由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。
则：从65℃—>50℃（每2cycles降退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。
实验中如持续出现假象带（杂带），则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。