Question

聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项

Answer 1

聚丙烯酰胺凝胶必须由丙烯酰胺单体、聚合起始物、催化剂以及合适的盐及缓冲液的混合物聚合起来。

丙烯酰胺与BIS (N, N’ – 亚甲双丙烯酰胺）是形成胶基质的单体。

过硫酸铵启动胶的聚合过程。胶的配方要求10% 以水配制的过硫酸铵溶液。大多数资料显示需要现配现用。但是，10 ％溶液可以在4℃放置数周而没有明显的活性丢失。最多配制10 ml, 当胶不能聚合时丢弃。

温馨提示 ：丙烯酰胺的百分比在测序胶和蛋白质胶中是不一样的。如果使用预制的丙烯酰胺：BIS 溶液，确保拿对瓶子。

TEMED (N, N, N’, N’ －四甲基乙二胺）是催化剂，装在棕色瓶中，置于冰箱。在即将倒胶之前添加。

聚丙烯酰胺测序胶加有胶缓冲液(TBE) 与尿素。尿素是变性剂，使DNA 反应中发夹环不易形成。

聚丙烯酰胺电泳所用的玻璃板在每次电泳之前及之后都应洗净。电泳之后，用软刷子和布在热肥皂水中清洗，再用蒸馏水淋洗，竖立待干。

水分及灰尘会导致带空洞的聚合物。电泳之前，用玻璃清洁剂清洗玻璃板，用软刷擦拭。蒸馏水淋洗，再用擦拭纸彻底擦干。用纸擦拭之前先用70% 乙醇冲洗有助于清洁，加速干燥。依次加样丙烯酰胺： BIS 、水、缓冲液、过硫酸铵、TEMED。混摇均匀，立即倾倒。

聚丙烯酰胺聚合前并不一定要脱气。（丙烯酰胺过去放置于真空中以除去气泡，因为氧气抑制聚合。）

水平胶点样小窍门。

组装胶盒

放一张黑色纸于胶盒下方，黑色背景使点样孔看得更清楚。

胶槽倒满缓冲液，刚好盖过胶体。

如果边上有灯，打开灯，让光直照胶体。把样品吸入移液器。

使用自动移液器。

插在10-200μ1 移液器上的枪头可用于大多数点样孔。对于非常小的（小于10μ1) 点样孔，用测序胶所用的长移液头比较方便。

将移液头刚好浸入样品，缓慢地吸入移液头。样品可能会因甘油而显黏稠，快速抽吸可能会把气泡吸入移液头。

样品吸入移液头之后，将移液头轻轻靠在管子边上，或者擦拭纸吸走移液头外边的液滴。注意别吸走样品。

将样品点到样品孔中

移液器上保持一点点压力，使样品略微溢出移液头。

把移液头插进缓冲液，略高于点样孔，保持正压。移液头的尖端部分可以伸进点祥孔。

缓慢而稳定地把样品打出去。移液头尖处于点样孔上方，样品会沉入孔中。让样品下沉充满样品孔，而不是推入。

一旦最后一滴样品打出移液头，将移液器推到第二档，缓慢地抬高移液器，移出缓冲液外

如何进行垂直胶的点祥？

垂直胶的点样孔形成于两块玻璃板之间。在非常薄的胶中，移液器移液头甚至不能插入到两块玻璃板之间。注意甘油！把移液头置于样品孔上方，样品会沉入到孔中。

点样之前，一定要把垂直型聚丙烯酰凝胶的点样孔冲洗干净。冲走未聚合的丙烯酰胺和样品孔底部可能出现的水，水可以使样品孔明显变小。用25ml 或者50ml 注射针筒和18 号针头。抽入电泳缓冲液，小心地冲洗样品孔中的水。

可能很难看清样品孔，但是点一个样之后，其余的就变得容易了。如果有多余的孔，可以用样品缓冲液与溴酚蓝试验。