同源重组构建质粒原理是什么?
非姐妹染色单体 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等,以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
同源重组反应通常根据交叉分子或Holliday结构(Holliday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段,即前联会体阶段、联会体形成和Holliday 结构的拆分。
同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性,100%重组的DNA分子之间的重组常见于非姐妹染色体之间的同源重组,称为Homologous Recombination,而小于100%同源性的DNA分子之间或分子之内的重组,则被称为Hemologus Recombination。
后者可被负责碱基错配对的蛋白如原核细胞内的MutS 或真核生物细胞内的MSH2-3等蛋白质“编辑”。
同源重组可以双向交换DNA分子,也可以单向转移DNA分子,后者又被称为基因转换(Gene Conversion)。由于同源重组严格依赖分子之间的同源性,因此,原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中,而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S期之后。
同源基因编辑原理:
CRISPR/Cas9系统是一种原核生物的免疫系统,是细菌用来抵抗病毒和外源质粒入侵的一种防御机制。目前最成熟且应用最广的是Type II的CRISPR/Cas9系统,其原理是利用gRNA特异性识别靶序列,并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割。
从而造成靶位点DNA双链断裂,随之利用细胞的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HDR)的方式对切割位点进行修复,实现DNA水平的敲除、敲入或点突变。