Question

PAGE原理（聚丙烯酰胺凝胶电泳）

请问，
PAGE原理（聚丙烯酰胺凝胶电泳）中，不连续电泳体系中的浓缩效应是如何产生的？

Answer 1

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamide
gel
electropHoresis,
PAGE)是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化作用下形成的三维网状结构物质。在不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的制作是分层进行的，因此凝胶不仅有分子筛效应，还具有浓缩效应。和琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶难于制备和处理。它们的分离范围较窄。但是它们也有突出的优点，由于是不连续的pH
梯度，故样品被压缩成一条狭窄的区带，因而增强了分离效果，提高电泳分辨率。尤其对小DNA
片段的分析(5～500bp)。在这一范围内，仅差1bp
的DNA
分子也能清晰地分开。其次，DNA
纯度很高。从聚丙烯酰胺凝胶中得到的DNA
纯度很高以致于下步操作不用任何处理。还有，它的负载容量高。该胶的标准加样槽中可以加入高达10mL
的DNA
样品，而不影响电泳分辨率。多应用于分离纯化和鉴定大小为5～500bp
的DNA
片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳有连续与不连续体系两种，前者指在整个电泳体系中的缓冲液pH
值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析。后者主要用于蛋白质样品的分离，它除了电泳槽中的缓冲体系和pH
值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH
值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成。
生物帮上面有这方面的详细内容，分子生物学缓冲液
http://product.bio1000.com/100250/

Answer 2

是不是说做PAGE的时候有浓缩胶和分离胶？
过浓缩胶是把蛋白压平，浓缩胶浓度大，所以蛋白在这一层被压平。然后进分离胶更容易分层

Answer 3

凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
缓冲液离子成分和pH的不连续性：在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl-，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小，仅为0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。
此外，电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用。

Answer 4

不连续电泳体系采用了两种或两种以上的缓冲液、PH值和孔径，能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨力。