Question

常用的蛋白质含量测定方法有哪些

Answer 1

　①凯氏定氮法
　　原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
　　②双缩脲法
　　原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
　　缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
　　③Folin酚法(Lowry)
　　Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
　　在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
　　灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
　　④紫外法
　　280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
　　280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
　　蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
　　⑤色素结合法（Bradford 法）
　　直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
　　考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
　　间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
　　⑥BCA法
　　BCA（Bicinchoninc acid procedure，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
　　它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
　　本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
　　⑦胶体金测定法
　　胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
　　胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
　　⑧其他方法
　　有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

Answer 2

测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。常见的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、酚试剂法及紫外吸收法。

1.凯氏定氮法

准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化，之后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

2.双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。首先利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并用只加入硫酸钠不含血清的试管作为对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，充分混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，由标准曲线上直接查出蛋白质含量。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。

3.酚试剂法

取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值

4.紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

5.其他

除了以上介绍的方法之外，考马斯亮蓝法、二喹啉甲酸法等均可用于蛋白质测定。