Question

RT-PCR的注意事项是什么?

Answer 1

实验中的一些好习惯
加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均
移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性
一定要记着关水浴箱,切记切记
多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了
所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因
防止RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间.
2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用）.
3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干.
4.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上.然后用高压灭菌除去残留的DEPC.不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌.
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换.
6.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用.
二、常用的RNA酶抑制剂
1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂.它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性.
2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活.它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用.
3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性.
4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白.RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活.
5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用.
因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA.而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染.
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等.
研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手.因此进行RNA实验时应勤换手套.