Question

血液提取RNA

Answer 1

需要准备的试剂：TRIzol（主要成分是苯酚）、氯仿（酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）、异丙醇、80%酒精（用RNase-free ddH2O配制）、RNase-free ddH2O。

实验流程

一、样品预处理（Sample Pretreatment）

①1毫升全血+1毫升RNase-free ddH2O。

②RNA血液保存液12000rpm离心5min，弃上清后加1毫升RNase-free ddH2O。

③200微升全血+1毫升RNase-free dd H2O。

④500微升全血+1500微升TRIzol（样品体积的3倍），彻底混匀。

所有样品在15-30℃放置5min。①②③样品在4℃下，12000rpm离心10min。

二、匀浆处理（Homogenization）

①②③弃上清后加入1毫升TRIzol，混匀。将①②③④样品在室温下放置5min。在4℃下，12000rpm离心10min。取上清至新的2毫升离心管中，加入2倍体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），剧烈震荡15s，室温放置3min，使其自然分相。

注：加入TRIzol后，如不需后续实验，可将样品放至-70℃长期保存。

三、RNA沉淀（RNA Precipitation）

1.在4℃下，12000rpm离心10min。

注：样品会分三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相。RNA主要在水相中，把水相转移至新管中。不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染。

2.吸取上清至新的离心管中，加入等体积的冰异丙醇，室温放置20-30min。在4℃下，12000rpm离心10min。RNA沉淀于管底。

四、RNA漂洗（RNA Wash）

1.弃液体，加入与TRIzol相同体积的80%酒精（用RNase-free ddH2O配制），缓慢的上下颠倒，悬浮沉淀，

2.在4℃下，12000rpm离心3min。弃液体，室温放置30min（液体蒸发完即可，不宜放置太久，RNA样品过于干燥会很难溶解）。

五、溶解RNA（Redissolving the RNA）

沉淀中加入30-100微升RNase-free ddH2O，用枪头吹打混匀。-70℃长期保存。