限制性内切酶酶切注意事项
限制性内切酶酶切注意事项
在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的条件，酶切反应的设计 一般应注意以下问题 ：
①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；
②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。
10.酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。
11.DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。
12.要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量，酶反应才能有效地进行。
13.反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。
14.高于37℃或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。
15.反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。
16.反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
17.用已硅化的离心管进行酶切反应，可获得更佳的酶切效果，否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。
18.终止酶反应可根据需要采用不同的方法：
①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应；
②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65℃保温20-30分钟，以灭活酶终止反应。
③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。
二、限制性酶解中常见的问题及解决措施 ：
限制性酶切割DNA底物的操作过程中，会出现一些问题，产生的原因主要为酶解体系中各要素处于非最佳状态，包括DNA的纯度和特性，反应缓冲液、反应体积、反应时间及温度等。
酶切反应的注意点：
1 20ul体系是最佳体系
2 20ul体系最多切2ug的DNA
3 甘油的量最好是低于体系的5%，最大不超过10%
4 酶切效率和酶的质量，保护碱基，酶切位点的位置（同一段DNA不同位置可以差很远，就算是都在中间也是一样的），酶切位点状态（如位点及周围几个碱基是否被甲基化等，有些甲基化后切不开，有些恰好相反。DAN的空间结构、识别序列的侧翼序列、DNA来源也有影响）酶的量，DNA的量，体系的纯净度（比如杂质的干扰，很多杂质如乙醇等可以明显抑制酶活性,另外还有DNase，蛋白质，EDTA，SDS，盐离子，酚氯仿），buffer的选择，是否加BSA,DNA 的状态（比如超螺旋状态DNA酶切效率低5倍－－这也是不能1ug质粒用1u酶切的原因，也不能只切1h的原因），星号活力等（也是因为杂质干扰或者甘油太多，buffer不合适，酶活性不稳定）
5 一般不好的酶需要8倍的酶量，切2－4h。如果是比较好的酶可以4倍酶量切2－4h，甚至可以一倍酶量切10h以上。 做的不好的酶一来有杂质酶污染，切久了污染的酶产生的影响会很明显，相对的酶量用大些引起的杂质酶切割问题要小些，所以采用大酶量短时间。 二来不好的酶不稳定，时间长了识别位点会发生变化，造成乱切的情况。所以采用了大酶量短时间的方法，虽然有些浪费。 而比较好的酶则相反。
注意酶加BSA目的一可以稳定酶，低浓度酶容易降解。二可以减少管臂对酶非特异吸附。
最好用孵箱不要用水浴箱，因为国产货不稳一不小心就39去了，对酶活性杀伤较大，孵箱至少不会突然很热了
