Question

PCR扩增后没有条带是怎么回事

Answer 1

PCR的反应条件与很多参数有关系。如模板浓度，引物长度及GC含量，引物浓度，dNTPs浓度，选用的taqenzyme,缓冲液的离子含量，产物大小，变性时间，退火温度及时间，延长的时间。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

扩展资料：

该反应分三步进行：

a、DNA模板（目的基因和引物）高温度变性（95°C）使之解链。

b、降温复性（40°C-60°C），使目的基因与引物杂交。

c、在70°C-75°C的温度下，DNA聚合酶进行酶促聚合反应，使目的基因DNA序列在3’位置上逐渐延伸。新合成的引物延伸链又可以作为下一步反应的模板，如此反复循环进行，按照2^n的指数扩增，短时间内可获得大量的DNA目的基因。

参考资料来源：百度百科-DNA的PCR扩增

Answer 2

PCR反应的关键环节：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量；④PCR条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析检测。
1）模板
a．模板质量不佳，含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白；模板核酸变性不彻底；提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。建议选择质量可靠的提取试剂，重新提取高纯度基因组模板；若模板为cDNA，需要检查逆转录反应及其所用RNA的纯度及完整度。
b．模板中含有尿嘧啶抑制高保真酶的活性，或含有Taq酶抑制剂。
c．模板浓度过高，或含有一些buffer，抑制PCR扩增，如cDNA模板，需经稀释后再使用。
d．靶序列变异。如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR不能有效扩增。
2）引物：引物的设计、引物质量是PCR扩增成败的关键。
a．引物设计不合理，如引物长度不够、引物之间形成二聚体等，需要重新设计引物。
b．合成高质量、高纯度级别的引物。
c．引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期4℃保存，导致引物降解失效。
3） 酶失活：
需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或活性降低而导致没有产物；或更换其它种类的PCR酶。
酶的质量：
a．酶失活，建议更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或活性降低而导致没有产物。
b．酶扩增效率低，建议更换扩增效率高的酶。
4）PCR条件:
a．PCR扩增条件：变性对PCR扩增相当重要，如变性温度低、变性时间短都有可能出现扩增无产物；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
b．Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败。
c．反应体系：反应体系配制错误，建议重复实验。通常进行PCR预实验采用的是小体系，正式实验如需扩大体系时，一定要重新摸索条件，否则容易出现扩增效果不理想或者失败。