Question

真核生物（如小鼠）的质粒如何提取，请写下详细步骤，谢谢

答得好的话加分哦

Answer 1

对于小鼠来说，质粒只存在于线粒体中
质粒提取可分为三个部分
1 裂解细胞
2 质粒DNA与染色体DNA的分离
3 纯化

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小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

1 材料和方法

1.1 实验动物 Balb-c小鼠，6周龄, 雌性, 购自北京大学医学院实验动物部。

1.2 质粒、菌株、细胞株和主要试剂 质粒pEGFP-N1、pGEM-T载体质粒、E coli.DH5a（天根公司）。低代次HEK293细胞株（本元正阳）。AdMaxTM Kit E试剂盒（Microbix Biosystems，Inc.）。Taq酶、T4 DNA连接酶（Takara公司）。限制性核酸内切酶XmaⅠ、Bgl II、Hind III（Biolabs）。Trizol 试剂、Lipofectamine 2000（Invitrogen）。逆转录试剂盒、PCR Master Mix（MBI）。质粒提取、胶纯化试剂盒（QIAGEN）。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶（Gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因测序由北京诺塞基因研究中心有限公司完成。

1.3 构建小鼠CD40Ig基因真核表达质粒

1.3.1 小鼠脾脏总RNA的提取：将小鼠以颈椎脱臼法处死，取出脾脏，加入液氮研磨后，用Trizol试剂提取总RNA，方法按产品说明进行。

1.3.2 CD40、IgG2a Fc、GFP基因的制备：以小鼠脾脏总RNA为模板，oligo-dT为引物，RT-PCR合成cDNA，再以此cDNA为模板，用CD40和mIgG Fc特异引物进行PCR扩增，另以pEGFP-N1质粒为模板进行PCR扩增，引物及PCR反应条件见表1，分别获得CD40、mIgG2a Fc和GFP基因。

1.3.3 质粒pGEM-IgG的构建：将IgG Fc的PCR产物与pGEM-T质粒进行TA连接反应，即10μl PCR产物加2μl的pGEM-T载体加10 U的T4连接酶，16 ℃过夜。取2μl的连接产物以氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，用蓝白斑方法挑选含氨苄青霉素抗性的白斑克隆，在3 ml LB培养基（含氨苄青霉素100 μg/ml）中37 ℃、80 r/min振荡培养过夜，提取质粒pGEM-IgG并测序。

1.3.4 质粒p516-IgG的构建：用Bgl II分别消化pGEM-IgG和pDC516，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后进行胶纯化。将IgG片段和pDC516线性载体按7:1的摩尔浓度比例加T4连接酶16 ℃过夜进行连接反应。取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，用pDC516-f和mIgG-r引物组合进行菌落PCR筛选正向插入的重组子（见表2），将PCR阳性的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。

1.3.5 质粒p516-CD40-IgG融合基因的构建：用Xma I分别消化CD40的PCR产物和p516-IgG，将CD40片段和pDC516-IgG 线性载体进行连接（方法同上）。转化大肠杆菌DH5α后，用pDC516-f和CD40-r引物组合进行菌落PCR筛选（见表2），将阳性结果的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。

1.3.6 PDC516-CD40-IgG-GFP质粒的构建：用Hind Ⅲ分别消化GFP的PCR产物和pDC516-CD40-IgG，将GFP片段和pDC516-CD-IgG 线性载体进行连接反应（方法同上），用GFP-f和pDC516-r引物组合进行菌落PCR筛选正向插入的重组子（见表2），提取质粒并测序。

1.3.7 PDC516-CD40-IgG-GFP质粒的大量制备：按QIAGEN EndoFree Plasmid Purification试剂盒说明进行制备，产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实（见图2），紫外分光光度仪测OD值，过滤除菌后-20 ℃保存备用。

1.3.8 重组质粒转染293细胞：在6孔板中将2.0×105个细胞接种于2 ml含血清不含抗生素的DMEM中，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，使细胞在转染时铺满平板的60%～70%。用Lipofectamine 2000转染试剂介导重组质粒转染，在无菌EP管中准备A、B两种溶液。A液：将4.0μg DNA溶于250μl无血清DMEM中，轻轻混匀；B液：将10μl Lipofectamine 2 000溶于250μl无血清培养液中，轻轻混匀，室温孵育5 min。将A液和B液混合并混匀，室温孵育20 min，以形成脂质体/DNA复合物。换去6孔板中旧的培养液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM，逐滴加入500μl脂质体/DNA复合物。在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h后换液。

2 结果

2.1 获得小鼠CD40胞外区、IgG2a Fc段及GFP基因 引物CD40-f和CD40-r经PCR扩增的小鼠CD40胞外区基因片段为572 bp；引物mIgG-f和mIgG-r经PCR扩增的小鼠IgG2a Fc段为700 bp；引物GFP-f和GFP-r经PCR扩增的GFP基因片段为765 bp。琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

2.2 pDC516-CD40-IgG-GFP真核表达质粒的成功构建

2.2.1 pDC516-IgG的构建：pGEM-T载体为3 000 bp的质粒，构建的pGEM-IgG质粒为3 700 bp。pGEM-T质粒的多克隆位点上游110 bp处含有T7 Primer序列，用T7+mIgG-r引物组合可扩增出约810 bp的片段，用T7 primer测序证实IgG序列的正确性。将IgG片段和pDC516线性载体进行连接反应，用pDC516-f测序证实IgG插入序列的正确性（见图3）。

2.2.2 pDC516-CD40-IgG的构建：将CD40片段和pDC516-IgG线性载体进行连接反应，用引物pDC516-f测序证实CD40插入序列的正确性。

2.2.3 pDC516-CD40-IgG-GFP质粒的构建：将GFP片段和pDC516-CD40-IgG 线性载体进行连接反应，用pDC516-r测序证实GFP插入序列的正确性。CD40-IgG-GFP含酶切位点的融合产物为2001bp，编码667aa（见图4）。

2.3 重组质粒在真核细胞内表达 pDC516-CD40-IgG-GFP质粒抽提后在紫外分光光度计下检测到OD值为0.1257。将该质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞的第4天开始可见零星的细胞上有GFP表达，随着时间的延长，GFP表达的细胞量逐渐增多，第7天左右在荧光显微镜下见大量的细胞有绿色荧光发生（见图5）。

参考资料：http://www.studa.net/yixue/081031/16370955-2.html

Answer 2

质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。
小鼠没有叶绿体，你可以直接参照小鼠线粒体的提取方法进行提取。

Answer 3

老大 老鼠没有质粒 质粒是有遗传效应的环状DNA 存在于大肠杆菌等细菌中

Answer 4

小鼠有质粒么?我记得好像没有吧.