Question

为什么我们基因克隆老失败

我们做的是拟南芥中一些基因cds的克隆，在设计引物时加上酶切位点，PCR之后通过酶切与载体相连。但是为什么老是失败，起初我们直接切得PCR产物，由于那样切没切开看不出来，所以我们先把PCR产物连在T载体上再切T载体，但是且过之后还是老连不上。有时候转化都长出菌落了但是菌落PCR却做不出来。我们用的T载体有pMD18-T pGM-T pEASY-T。请高人给一些克隆方面的指点吧，我们现在的进度一个月能做成一个克隆就不错了。

Answer 1

1 建议你直接切PCR产物，在酶切位点两端加2~3个保护碱基再切。这样避免两次纯化的麻烦。我都是这么做的。
2 你的T载体连接成功了么？就是有没有拿到重组T载体？
3 你用的是Taq还是高保真聚合酶？如果是Taq的话当心是在引物区或酶切位点造成点突变使得切不动。

Answer 2

反正我自己做的时候是 pcr切下来之后做纯化，然后再连接T载体。然后转化，再涂板。我比较落后，还用的是蓝白斑 。就可以了。

Answer 3

用TOPO克隆吧。