Question

植物染色体DNA的抽取及浓度测定

谁有这个实验的具体的实验目的，实验原理，实验方法等。谢谢谢谢

Answer 1

目的意义
DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。因此，本实验的目的是学习植物基因组DNA提取方法、原理和DNA的鉴定技术。

Ⅰ 植物基因组DNA 的提取（CTAB法）
一、原理
植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：
（1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。
（2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。
（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。
（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。
（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。
分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。

二、操作方法
（1） 取200mg样品(在液氮中研磨成粉末状)放入1.5mL离心管中，加入600μL DNA提取液，颠倒混匀5-6次。65℃保温35分钟以上，其间颠倒混匀一次。
（2）再加等体积的氯仿异戊醇(24：1)溶液轻轻摇晃30秒，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，取吸上清液(450μL)
（3） 再加两倍体积的预冷异丙醇，混匀静止10分钟以上，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，弃上清。
（4） 用600μL70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温下倒置晾干。
（5）沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度50μg/mL，在37℃下保温半小时，将DNA样品放入冰箱保存。

Ⅱ 植物DNA 纯度的鉴定——紫外分光光度计法

一、原理
由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
纯度鉴定时，需测定在230、260和280nm处的消光值，经验数据表明，
纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。
含量测定时，对于纯净的DNA来说，在实际应用中可根据260nm处的消光值O.D260值换算成含量，一般认为O.D260值为1时，相当于50μg/ml。在测定核酸粗制品时，样品中残留的蛋白质和色素等与其它具紫外吸收的杂质对测定有明显干扰作用，大分子核酸制备过程中变性降解后有增色效应，因此有时此法测定的结果会高于定磷法。
二、实验材料、仪器及试剂
1、材料 植物DNA
2、器材：紫外分光光度计、移液管、试管
3、试剂：TE溶液（pH8.0）（见前述）
三、操作方法
将纯化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀释至每毫升含5-50μg DNA浓度范围，用TE（pH8.0）作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm和230nm吸收值，计算A260/A230和A260/A280的比值，并换算出核酸的含量。

Ⅲ 植物DNA 分子量的测定——琼脂糖凝胶电泳法
一、原理
以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛应用于核酸研究中，其操作简单、快速，是分离、鉴定、纯化DNA的标准方法。DNA分子在高于其等电点的pH溶液带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，还有凝胶介质的分子筛效应，也就是说与分子大小构象有关。实验表明DNA迁移率与其分子量的对数成反比。因此通过参比已知标准分子量的DNA迁移率，可测定样品DNA的分子量。用低浓度的荧光物质，插入性染料溴化乙锭（EB）使凝胶中DNA区带染色，在紫外光下可直接显示DNA在凝胶中的位置，灵敏度很高，可检出10ng（10-9g）或更少的DNA含量。
二、实验材料、仪器及试剂
1、材料： 植物DNA
2、器材：水平板型电泳槽装置 电泳仪 254nm波长的紫外分析仪塑料手套 移液管 水浴锅
3、试剂：
（1）T ris-HAc(TAE)缓冲液
A．浓缩的贮备液（50倍）每升含：242gTris 57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。
B．使用浓度：0.04mol/L Tris-HAc/0.04mol/L EDTA。
（2） 琼脂糖：电泳纯以上。
（3）溴酚蓝甘油溶液（0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液）：先配制0.1%溴酚蓝水溶液，然后取1份0.1%溴酚蓝溶液与等体积的甘油混合即成。
（4）已知分子量的标准DNA（λDNA-ECORI/Hind III）。
（5） 10mg/mL溴化乙锭水溶液（EB）或GV水溶液。

三、操作方法
1．琼脂糖凝胶板的制备
称取0.7g琼脂糖置于三角瓶中，加入100mlTAE缓冲液，在沸水浴中加热至琼脂糖完全溶解，冷却至50℃，然后加入EB溶液使终浓度为0.5μg/ml。倒入凹形有机玻璃槽（事先用胶带封住有机物玻璃板的边缘）。使其成2mm左右的凝胶板。在其未凝固前将样品槽模板（梳子）插入凝胶的一端，注意梳齿底与凝胶底之间应至少保持0.5-1.0mm的凝胶。待全部凝固后（室温，约30-45分钟），取出梳子及除去胶带，将凝胶板与玻璃板一起放入电泳槽内，加入TAE缓冲液使刚好超过凝胶面约1mm。
2．加样：将样品与溴酚蓝按4：1的比例混合，用移液器缓慢加入凝胶样品孔中，点样量为每孔5μgDNA。
3．电泳：点样端接负极，电泳开始时，可用较高的电压，如100伏特，这样可使样品很快进入胶内，而减少样品扩散，待样品进入胶内即可保持每厘米
5伏特左右的电压，DNA在电泳中向正极移动。当溴酚蓝的区带移至距凝胶底部1-2cm，停止电泳，当胶板为10-15cm的长度时，电泳时间一般为2小时左右。
(4)观察与鉴定
电泳结束后，取出凝胶板，在波长为254nm的凝胶成像系统下，观察电泳图谱，如果电泳条带清晰(如果EB染色看到桔黄色荧光条带，GV染色则看到绿色荧光条带)，将凝胶照相。根据标准DNA的电泳图谱，可以得知样品DNA的分子大小。

Answer 2

你得有设备才行，光学显微镜一台。各种仪器，化学试剂，估计下来建一个实验室得500万

Answer 3

　　植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。十六烷基三甲基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀。
　　浓度的测定，需测定在230、260和280nm处的消光值，经验数据表明，纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。

Answer 4

植物基因组提取及DNA的浓度测定
一、实验目的
1、 掌握用CTAB法提取植物总DNA的方法和基本原理。 2、 学习利用紫外分光光度计法测定DNA溶液的浓度。
二、实验原理
1、2%CTAB抽提缓冲液在65摄氏度水浴中预热，与此同时，用剪刀、镊子取8片约0.2g的子叶于研钵中，放在冰水研至匀浆状。
2、用移液器向研钵中加入700微升2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅拌。然后将研磨液倒入1.5ml的灭菌离心管中，再置于65摄氏度的恒温水浴锅中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出。
3、冷却2min后，用移液器吸700微升的氯仿/异戊醇到离心管中，剧烈振荡2~3min，使两者混合均匀。
4、与另一组同学的离心管平衡，对称放入离心机中，10000r/min离心10min，与此同时，将60微升的预冷的异丙醇加入另一个新的灭菌离心管中。
5、移液器轻轻地吸取上清液（约600微升），转入含有异戊醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能看到DNA絮状物。
6、同样，与另一组同学的离心管平衡，对称放入离心机中，10000r/min离心1min，然后立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出。
7、将离心管倒立于滤纸上1min，直立离心管，加入720微升的75%的预冷的乙醇及80微升5mol/L的乙醇钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中。放置10min，使DNA块状物的不纯物溶解。
8、与另一组同学的平衡，对称放入离心机，10000r/min离心1min，倒掉液体，再加入800微升75%乙醇，将DNA再洗2min。
9、与另一组同学的平衡，对称放入离心机，10000r/min离心30s，立即倒掉液体，将离心管倒立于滤纸上，数分钟后，直立离心管，干燥DNA。
10、加入50微升0.5XTE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37摄氏度恒温箱中约1.5h，消化RNA。
11、取2.99ml蒸馏水至一干净的试管，再加入上述DNA溶液10微升，混匀。 12、先3ml蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，比较两杯差异，然后倒掉其中一杯蒸馏水，加入3ml已稀释的DNA溶液，测定260nm及280nm的光吸收值
注意事项：
1、 镊子、剪刀、研钵、子叶都得用酒精消毒。 2、 叶片磨得越细越好。 3、 移液器使用时，要注意量程，枪头加同一液体且没被溶液污染时，可重复使用，
加入不同液体或被溶液污染时，要换枪头。
4、 吸取含DNA时要用剪短的枪头，减少机械切割力对DNA的破坏。
5、 移液器使用时要始终保持竖直，或稍微倾斜，不可平拿，甚至倒过来，防止液
体进入移液器中，污染移液器。 6、 紫外分光光度计要预热。
7、 紫外分光光度计打开盖，使指示灯指向T，使透光率为0，盖上盖，使透光率
为100%，然后使指示灯指向A,进行测量。 8、 要比较两杯的差异，提高结果的准确性。

四、实验结果

A260 A280 装溶液的比色杯与另一个比色杯的差值 0.005 0.004 溶液
0.118 0.054 溶液的最终值
0.113
0.05
A260/A280=0.113/0.050=2.26 dsDNA=50*(A260)*稀释倍数 =50*0.113*300 =1695微克/ml 分析：
1、 采用机械研磨的方法，可破坏植物的组织和细胞，为了防止匀浆中各种酶类（尤其
是氧化酶类），抽提缓冲液中的B-巯基乙醇可降低这些酶类的活性，同时，在冰上研磨，有两方面的作用：（1）、降低酶的活性，（2）、使细胞中水结晶，细胞膨胀，利于材料的破碎。
2、 CTAN表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以
游离出来。
3、 抽提缓冲液中的EDTA为金属螯合剂，能除去匀浆液中的Mg2+和Mn2+，抑制DNA
酶的活性。
4、 抽提缓冲液中的Nacl浓度很高，DNP易溶于高盐溶液，RNP在高盐溶液中溶解度
不大，以分离DNP和RNP。 5、 氯仿能使蛋白质变性，同时有吸收匀浆液中色素的作用。异戊醇防止液相之间起泡，
利于液相分离。这样DNA溶于上层CTAB抽提液中，细胞碎片在下层，变性蛋白质在中间。
6、 第2步的轻轻振荡，是为了防止DNA受破坏，第3步的剧烈振荡是为了DNP中蛋
白质与DNA的分离。
7、 异戊醇一方面：除去CTAB，因为CTAB易溶于异丙醇，另一方面：沉淀DNA。 8、 离心后那可除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入预冷的乙醇使DNA沉淀，
因为DNA难溶于乙醇冷的乙醇效果更佳。 9、 最后的TE缓冲液中含RNA酶，消化RNA。 10、 抽提缓冲液中Tris-Hcl使DNA保持天然的完整状态。 11、 DNA的吸收光谱峰在260nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的A值，
当A260=1时，双链DNA含量约为50微克/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处。如果A260/A280在1.8-2.0时，认为以达到较高的纯度，如低于此值其中蛋白质较多，如高于此值说明其中含RNA或DNA片段过多。 12、 本实验A260/A280=2.26>2.0，很可能是DNA片段过多，因为本实验第5步没
用剪短的枪头。 13、 比较两比色杯的差异，是因为比色杯可能不标准，会产生小的误差，通过记录
两者的差异，然后通过结果相减可消除这种差异造成的影响。 14、 DNA溶液的浓度可用dsDNA=50*(A260)*稀释倍数来算。

Answer 5

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