Question

细菌中革兰氏染色法的过程是怎样的

Answer 1

微生物的染色方法很多,各种方法应用的染料也不尽相同,但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序.
1、制片
在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水,用接种环进行无菌操作,挑取培养物少许,置载玻片的水滴中,与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层,为避免因菌数过多聚成集团,不利观察个体形态,可在载玻片之一侧再加一滴水,从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释,涂布成薄层,若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液,则直接涂布于载玻片上即可.
2、自然干燥
涂片最好在室温下使其自然干燥,有时为了使之干得更快些,可将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形.
3、固定
标本干燥后即进行固定,固定的目的有三个：
1）杀死微生物,固定细胞结构.
2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上,防止标本被水冲洗掉.
3）改变染料对细胞的通透性,因为死的原生质比活的原生质易于染色.
固定常常利用高温,手执载玻片的一端（涂有标本的远端）,标本向上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3—4次,共约2—3秒钟,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后,进行染色.
以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍,但是应当指出,在研究微生物细胞结构时不适用,应采用化学固定法.化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%）,酒精和醚各半的混合物,丙酮,1—2%的饿酸等.饿酸能很快固定细胞但不改变其结构,故较常用.应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃,在玻璃上放置玻璃毛细管,在毛细管中注入少量的1—2%饿酸溶液,同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片,然后把培养皿盖上,经过1—2分钟后把标本从培养皿中取出,并使之干燥.
4、染色
标本固定后,滴加染色液.染色的时间各不相同,视标本与染料的性质而定,有时染色时还要加热.染料作用标本的时间平均约1—3分钟,而所有的染色时间内,整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中.
若作复合染色,在媒染处理时,媒染剂与染料形成不溶性化合物,可增加染料和细菌的亲和力.一般固定后媒染,但也可以结合固定或染色同时进行.
5、脱色
用醇类或酸类处理染色的细胞,使之脱色.可检查染料与细胞结合的稳定程度,鉴别不同种类的细菌.常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液.
6、复染
脱色后再用一种染色剂进行染色,与不被脱色部位形成鲜明的对照,便于观察.革氏染色在酒精脱色后用番红,石碳酸复红最后进行染色,就是复染.
7、水洗
染色到一定的时候,用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉,被菌体吸附的染料则保留.
8、干燥
着色标本洗净后,将标本晾干,或用吸水纸把多余的水吸去,然后晾干或微热烘干,用吸水纸时,切勿使载玻片翻转,以免将菌体擦掉.
9、镜检
干燥后的标本可用显微镜观察.
综上所述,染色的基本程序如下：
制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检.