Question

实时荧光定量PCR中两种引物的设计有什么要求

Answer 1

1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp
2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；
4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；
5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；
6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；
7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；
8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；
9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；
10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；
11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；
12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。
13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。

Answer 2

参照以下real-time PCR引物设计原则：
1.最好位于编码区5’端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果.
2.产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）.
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大.
4.G+C含量在40%~60%之间,45-55％最佳.
5.碱基要随机分布,尽量均匀.
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补.
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补.
8.引物5′端可以修饰.
9.3’端不要以A结尾,3′端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C,A/G连续结构（2-3个）.
10.引物3′端要避开密码子的第3位.
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol.可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况.
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染,最好跨外显子接头区.
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源.
15.查看有无假基因的存在.假基因就是无功能的DNA序列,与需要扩增的目的片段长度相似.
16.TM值在55-63度之间.
17..引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源.

Answer 3

1、染料法引物的设计原则：
（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；
（2）、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物
自身形成环状发卡结构；
（3）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显
子；
（4）、引物之间的TM相差避免超过2℃；
（5）、典型的引物18到24个核苷长；
（6）、目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致，不大于
300bp，这样有利于使两种基因PCR效率相同
（7）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性
2、Taqman探针及引物的设计原则：
（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；
（2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显
子；
（3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右；
（4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使
是被切割下来还会存在淬灭作用；
（5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反应
效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
（6）、引物之间的TM相差避免超过2℃；
（7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp；
（8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同；
（9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性

Answer 4

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