【科研】PCR引物设计原则
洁思隆新材料（苏州）有限公司是一家专注于PCR材料再生和科研的公司，为创造更加安全、舒适、纯净，便捷的人类生活提供全新的材料解决方案的新材料企业。推动人类生活环境的持续改善，创造美好生活。
洁思隆新材料(苏州)有限公司座落在有着“上有天堂，下有苏杭”之称的苏州，它也是一座园林城市。一座有底蕴的美丽城市，一家有责任的新兴公司。我们会在这花园的城市里，萃取自己的产品，不忘初心，为青山绿水，贡献自己的一点力量!
洁思隆新材料（苏州）有限公司，已深耕塑料行业多年。近年来随着经济的发展，环境的污染成为社会的主要议题，洁思隆新材料（苏州）有限公司认为一个有社会责任感的公司要为社会碳中和贡献自己一点力量。为此公司决定致力于塑料的循环利用，再生料的溯源，化学品的使用，环境的保护，社会责任的提升，洁塑隆一直在行动。
遵循原则如下：
1. 引物长度：引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25-35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。引物过短，会降低产物的特异性，每增加一个核苷酸，引物特异性可以提高 4 倍。引物过长，会使退火过程不完全，与模板结合不充分，以至引起扩增产物的明显减少。
2. 引物末端： 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；引物 3’端应避免出现发夹结构。
3. 引物G+C：含量 引物的GC含量控制在40%-60%之间。
4. Tm值：引物额外附加序列，即与模板非互配对序列，不应参与引物 Tm 的值计算；正向引物和反向引物的Tm值相差不超过5℃为佳，Tm值调整至55℃ -65℃为佳。
5. 碱基的分布：引物 A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；避免连续出现4个及以上的相同碱基，或者某两个核苷酸连续重复出现（例如，ACCCC或ATATATAT；引物内部或者两条引物之间避免有5个碱基以上的互补序列；两条引物的 3’端避免有3个碱基以上的互补序列。
6. 序列特异性：引物设计完毕请使用 NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。注意: PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。
GRS塑料
2024-11-04 广告
① 特异性：引物应在保守区内设计并具有特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
② 引物长度： 一般在15~30碱基之间 ，引物有效长度Ln=2(G+C)+A+T，Ln值不能大于38。（Ln>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度74℃，不能保证产物的特异性）
③ 目的片段二级结构：要扩增的片段单链不能形成二级结构，扩增片段长度为100~600碱基对。
④ 引物二级结构：引物自身连续互补碱基不能多于3bp，一对引物间连续碱基的同源性或互补性不能多于4bp。
⑤ 引物的5′端：可以被修饰而不影响扩增的特异性。5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点；插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。
⑥ 引物的3′端： 绝对不能进行任何修饰，3′端也不能有形成任何二级结构的可能 ，引物3′端不要终止于密码子的第3位。
⑦ TM值：按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为50~70℃。 尽可能保证上下游引物的Tm值一致 ，一般不超过 2℃。若引物中的 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。退火温度约为TM-4。
⑧ GC含量：G+C含量在40%~60%之间。四种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。
