二代测序原理及应用
二代测序又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。
关于二代测序的临床应用：
二代测序作为一种检测手段，主要应用于基因的生殖变异（遗传性）与体细胞变异（获得性）的检测。对于遗传病，主要的技术方案是靶向区域测序（targeted panel），全外显子测序（whole exome），全基因组测序（whole genome）和线粒体DNA测序。
其中，靶向区域测序主要针对明确表型的疾病相关基因进行测序，常见的panel有：免疫缺陷panel，骨髓衰竭综合征panel，致盲或致聋缺陷panel，线粒体病panel，肾脏疾病panel，神经疾病panel，结缔组织疾病panel，心肌疾病panel和遗传性肿瘤易感panel等。
靶向测序类方案有最大的特点是不同实验室由于方案制定与panel设计的年代局限，检测的基因范围都会有不一样。对于肿瘤类检测，由于针对的样本类型不一样，使用场景的设计不一样。
更是大多区分为：1.针对每个基因的编码区域，或者加上UTR甚至外显子的边沿（exon padding，为了更好的发现剪切体变异--splicing mutation），2.针对某些临床证据或者药物作用靶点/耐药位点的特定热点（hotspot panel）。
另外还有基于胎儿游离DNA的NIPT也是二代测序在转化医学中非常经典的应用例子。随着技术的成熟，二代测序也开始应用于肿瘤游离DNA的检测，HLA的分型，病原体检测，转录组测序，以及甲基化测序。
但是这些领域的应用，特别是对ctDNA的二代测序应用于肿瘤早筛，学界仍存在担忧，作者主要是提出两点：1.在正常人的游离DNA中也能检测出假阳性的驱动变异，2.在某些早期阶段的肿瘤，ctDNA NGS的灵敏度可能存在不足（30%~60%）。这两点可能限制ctDNA用于肿瘤早期筛查的适用性。
关于二代测序的技术方案：
目前二代测序主要技术方案，是靶向区域测序（panel），从靶向区域获取的技术来区分主要分为液相捕获技术（采用RNA探针或者DNA探针），以及PCR目标区域捕获技术。通常的，液相捕获是先把DNA片段化为特定的长度（酶切或者超声），加入接头，然后用探针捕获。而PCR捕获不需要DNA片段化，直接先PCR把目标区域富集然后再加接头。
而不论是哪种捕获技术，靶向区域测序一般都有以下环节：DNA提取，文库制备，目标区域富集，上机测序四大环节。
DNA提取：
常规DNA提取一般都能满足二代测序的样本要求。但是对于肿瘤的FFPE样本处理起来要特别小心，特别是对于陈旧的样本来源，DNA损伤与降解非常常见，而且FFPE样本一般要经过显微切割与脱腊等步骤，也可能造成DNA的得率的下降。DNA提取的一个很关键的质控步骤，一般选择Qubit来定量，因为低浓度DNA Qubit的测量值比NanoDrop相对更灵敏一点。
迈杰
2023-04-14 广告
