Question

百思不解！！PCR之后胶回收没有亮带

我的PCR产物跑胶条带很亮，位置也正确，但是胶回收之后再跑胶验证就没有任何亮带了（maker正常），重复了三次，结果都一样。我的产物是196bp，我开始怀疑是不是胶回收试剂盒不匹配，我看了说明书，博大泰克的B型小量胶回收试剂盒，100bp-200bp的回收率是大于70%，然后我怀疑是不是上样太少（之前加的是5微升的样品和1微升的6Xloading buffer），就改加10微升的样品加2微升的6Xloading buffer，结果还是没有亮带！我现在的心情恐怕用郁闷两个字是不足以形容的了！请各位帮忙！谢谢！
后来我把四条胶带回收成30微升，亮度及其微弱，说明试剂盒对196bp的小片段回收率不高，并且，我用一条胶带回收后的片段做重叠PCR居然可以做出来（胶回收之后再跑胶无亮带，已根据片段大小和maker调整过胶弄浓度和时间），并且现在已经表达 出来蛋白了。说明我的操作是没有问题的，胶回收之后根本没必要再跑胶。

Answer 1

这应该是你在回收的过程中出现的问题,认真看看试剂盒,看看漂洗液是不是加了无水乙醇,上了回收柱之后,离心下来,可以再重新上下柱离心下,化胶的时候不要太久,洗脱的时候也是一样,离心下来之后再上柱洗脱一下,洗脱液预热==,还有是不是你回收胶上样太少了,损失较大

Answer 2

肯定是没有回收回来 别人用那试剂盒回收效果怎么样啊?我觉得可能是试剂盒有问题。
我们用的是塔克拉的回收试剂盒，就是磁珠的那种，50UL回收后加35ul的水或TE，检测跑1UL足以检测出来，量大时比MARKER还要亮很多。如果别人也有问题建议你找试剂公司的人给你换一盒试试

Answer 3

你回收只加10微升的样品？太少了，催然说明书中说有70%的回收率，但是实际上根本没有！

建议：用大孔的琼脂糖胶跑，加样至少50ul，这样回收后体积约为30ul，此时应该浓了。

Answer 4

你最后用多少微升TE或ddH2O溶解柱子上的DNA？可以适当加少点，以增加浓度。还有你操作过程中有没有问题。