什么是PCR技术?
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PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程,在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术,主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2ⁿ倍。
PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件:(①变性:加热使模板DNA在高温下(94℃左右)双链间的氢键断裂而形成两条单链;②退火;使溶液温度降至50~60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。
3、延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5'一3’方向复制出互补DNA。
扩展资料
【技术原理】
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。
因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
【工作原理】
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:模板DNA经加热至90~95℃一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。
②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至50~60℃,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于70~75℃,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”。
而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
【工作步骤】
标准的PCR过程分为三步:
1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
2.退火(复性)(40℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
参考资料来源:百度百科-PCR技术
2024-11-04 广告
PCR技术也就是基因扩增技术,它是通过基因扩增仪,在细胞外进行DNA复制,由1个DNA分子增加到2个,然后依次增加到4个,8个…,使分子数目呈几何级数增加,以在短时间内获得足够的DNA,供研究用的一种技术。
PCR技术的出现,使生物学的研究一大突破。在PCR技术问世之前,人们无法查出爱滋病病毒感染者,因为这种病毒在感染者体内的含量很少,且难于培养。在PCR技术问世之后,可将爱滋病病毒的核酸进行扩增从而查出受感染者,并可研究治疗方法。
PCR技术已经在分子生物学中发挥了重要作用。可以预知,它在遗传病诊断、治疗,在动、植物育种,以及在司法破案等方面,将会发挥更大的作用。
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2020-04-17
PCR技术的原理是什么
扩增DNA的方法